1. 概述

1.1. 背景及分析流程简介

为了理解细胞中更为复杂的生物过程，许多研究已在通过比较ChIP-seq的差异获得的不同数据。越来越多的ChIP-seq实验正在研究多种实验条件（例如各种治疗条件，几个不同的时间点和不同的治疗剂量水平）下的转录因子结合，组蛋白修饰的差异。差异富集在生物学和医学研究中已变得具有实际重要性。为了建立对比条件消除误差，我们对数据进行了以下流程处理：我们首先将A与B两组的结果进行共有Peak区域基因计算，对于有共有区域(overlap)的Peak，计算最高峰位点并向其两侧各延伸250bp作为合并峰计算区域，对每个区域进行的每组样本进行reads表达定量，进行差异Peak的计算，筛选出差异Peak，进行临近3K注释到基因上，进行基因集富集分析。

本组实验结果，我们处理的是有两组重复的DiffPeak数据对比，我们的差异Peak筛选标准为：|log2FC| > 1 && FDR < 0.05。

分析流程:

1.2. 结果汇总

路径	说明
差异Peak分析结果, 目录: `Results/`
`Results/*DiffPeakInfo.xls`	差异Peak计算的所有结果
`Results/*DiffPeakInfo.bed`	差异Peak计算的所有结果的bed文件
`Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05.xls`	差异Peak计算结果按阈值筛选后结果
`Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05.bed`	差异Peak计算结果按阈值筛选后结果的bed文件
`Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_GAIN.bed`	差异Peak计算结果按阈值筛选后结果的bed文件（差异上调）
`Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_LOSS.bed`	差异Peak计算结果按阈值筛选后结果的bed文件（差异下调）
`Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.xls`	差异Peak计算结果按阈值筛选后结果的临近注释文件
`Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.sorted.xls`	同上，差异Peak计算结果按阈值筛选后结果的临近注释文件（按annotation(Promoter), Fold, FDR列排序）
`Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno_gene.bed`	注释到的基因(转录本)信息标记bed文件
差异Peak分析绘图结果, 目录: `Results/Plot`
`Results/Plot/1cor_peakScore_*.png`	peak相关性热图分析
`Results/Plot/1pca_peakScore_*.png`	peak相关性PCA分析
`Results/Plot/2cor_readCount_*.png`	共有区域的readCount相关性热图分析
`Results/Plot/2pca_readCount_*.png`	共有区域的readCount相关性PCA分析
`Results/Plot/*_1cor.png`	差异Peak相关性热图分析
`Results/Plot/*_2pca.png`	差异Peak的PCA分析
`Results/Plot/*_3ma.png`	差异Peak的MA图
`Results/Plot/*_4vol.png`	差异Peak的火山图
`Results/Plot/*_5box.png`	差异Peak的箱型图
`Results/Plot/*_6heatmap.png`	差异Peak的热图
显著差异Peak的临近基因集富集分析, 目录: `Results/Enrich/`
`Results/3.Enrich/*/`	各组差异Peak的临近注释基因集的富集分析结果目录
`Results/3.Enrich/*.html`	辅助查看富集结果的网页文件
`Results/3.Enrich//-p.adjust1.00.csv`	富集分析结果列表（原始）
`Results/3.Enrich//-p.adjust0.05.csv`	富集分析结果列表（按padj<0.05筛选后）
`Results/3.Enrich//.pdf`	富集分析的绘图高清文件

* 以上重要结果为加粗显示。

2. 分析流程

2.1. 重叠区域的计算

2.1.1. PeakScore相关性分析

为了进行后续的差异Peak的富集程度比较，我们需要合并Peak比较区域，在overlap的共有区域计算前，我们需要先了解各组内的peak重复性情况。对Treat组和Control组进行PeakScore相关性热图分析，PCA分析。

Results/Plot/1cor_peakScore_Demo_A-B.png	Results/Plot/1cor_peakScore_Demo_C-D.png
Results/Plot/1pca_peakScore_Demo_A-B.png	Results/Plot/1pca_peakScore_Demo_C-D.png

2.1.2. readsCount相关性分析

我们选取至少含有overlap区域>=2个样本的callPeak区域结果，计算最高峰位点并向其两侧各延伸250bp作为合并峰计算区域，对每个区域每组样本进行reads表达定量。随后，我们对各组进行readsCount的相关性热图分析，PCA分析。

Results/Plot/2cor_readCount_Demo_A-B.png	Results/Plot/2cor_readCount_Demo_C-D.png
Results/Plot/2pca_readCount_Demo_A-B.png	Results/Plot/2pca_readCount_Demo_C-D.png

2.2. 差异Peak的计算

2.2.1. 差异Peak的相关性计算及显著性差异Peak的筛选

通过计算两组之间的合并区域的表达差异，我们能获得两组比较计算的差异Peak所有结果。通过相关性热图及PCA，可以看出组内的差异peak计算的相关性好坏，一般而言好的结果能明显区分开。通过阈值|log2FC| > 1 & FDR < 0.05进行筛选获得显著差异Peak筛选结果，进行相关性热图，PCA，火山图，热图绘制如下。

通过差异Peak分析，我们得到了基因组范围内的差异Peak信息，为进一步得到差异Peak附近的临近基因信息，我们使用Chipseeker进行进一步注释，得到Peak所对应的临近注释基因，并给出Peak在Promoter的上下游3k，或之外的Intron、Exon等区域的位置及距离等信息的注释文件: Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.xls。

Results/Plot/Demo_A-vs-B_1cor.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_1cor.png
Results/Plot/Demo_A-vs-B_2pca.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_2pca.png
Results/Plot/Demo_A-vs-B_4vol.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_4vol.png
Results/Plot/Demo_A-vs-B_6heatmap.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_6heatmap.png

Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.xls表头说明：

表头	说明
`peakname`	差异Peak的name
`seqnames`	差异Peak所在染色体
`start`	差异Peak在参考序列上的起始位置
`end`	差异Peak在参考序列上的终止位置
`width`	差异Peak的长度信息
`strand`	正负链信息
`Conc`	Group1和Group2平均值进行log2标准化后的计数
`Conc_Group1`	Group1进行log2标准化后的计数
`Conc_Group2`	Group2进行log2标准化后的计数
`Fold`	Group1与Group2的差异倍数（进行log2标准化）
`p.value`	差异Peak的置信度计算
`FDR`	差异Peak的多重校验FDR
`change`	上下调标记，上调标记为GAIN，下调标记为LOSS
`annotation`	peak注释信息（对于注释到基因上等注释信息的描述）
`geneChr`	注释基因的染色体信息
`geneStart`	注释基因的起始位置
`geneEnd`	注释基因的终止位置
`geneLength`	注释基因的长度
`geneStrand`	注释基因的正负链
`geneId`	注释基因的EntrezID
`transcriptId`	注释基因的转录本名字
`distanceToTSS`	被注释Peak距离TSS的距离
`ENSEMBL`	注释基因的ENSEMBL名
`SYMBOL`	注释基因的SYMBOL名
`GENENAME`	注释基因的基本描述信息

2.2.2. 差异Peak注释基因的富集分析

将上述临近注释得到的基因集，进一步进行GO和KEGG富集分析，得到差异Peak筛选结果的临近注释基因富集结果。结果文件说明及解读，同CHIP标准分析流程报告。

结果目录： Results/Enrich/

3. 结果的IGV可视化

为了得到较为直观的测序分析结果，我们一般需要借助可视化工具，IGV在这个过程中扮演十分出色的角色，他不仅展示了不同样本测序覆盖情况，还常常用于联合分析，如mRNA的测序变化与chip测序的变化。在此项目中，我们用于差异Peak的筛选与评估，我们可将分析结果文件导入，步骤如下：

导入CHIP分析结果，即前面我们的Chip标准分析结果中.bigwig与.narrowPeak文件。
导入CHIP的差异Peak分析结果，即本分析中所得到的bed结果。
调节数据显示范围：

bigwig 高度范围显示调节：按住 ctrl / command 选中多个.bigwig文件，右击点击 Set Data Range...。为方便对比，在对比不同区域Peak时，可手动调节显示范围。
bed / gene 重叠区域展开设置：右击bed文件，点击 Expanded 设置展开。

搜索感兴趣的 Peakname / SYMBOL：在第一排第三个框内输入Peakname / SYMBOL名，点击GO即可搜索。如果搜索不到，可尝试点击Reload重新加载。

筛选的 Peakname / SYMBOL 的一些方法：

搜索感兴趣的Peak，可参考：Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.sorted.xls，该文件按annotation(Promoter), Fold, FDR列排序，即Promoter上游3K区域差异倍数较大的结果将被优先排序。排名较前的结果具有一定的显著差异Peak筛选价值。
搜索感兴趣的Gene，可根据生物学功能研究，挑选出较有意义的功能富集结果的基因集，反向去看差异Peak变化情况。上述分析的功能富集结果具有一定的参考意义。

Demo展示：

一个示例如下，在该IGV中通过可视化，可读出的信息有：在 A vs B 的差异Peak对比中， Peakname 为 54218, 54219, 54220, 54221 的这些Peak比较区域， A相对B具有显著下调趋势，它们都被临近注释到CCL2基因上，注释类型为3K内的Promoter。

示例图：