这里我们就要讲讲如何从海量的芯片数据中寻找到差异表达的基因。
首先，我们得知道为什么我们需要找这些差异表达的基因。其实在肿瘤的发生发展过程中，很多平时沉默的基因开始高表达，而原本那些正常表达的基因，它们的表达量可能就会下调。也恰恰这些与平时正常基因表达量发生变化的基因，它们的存在启动了肿瘤的发生。所以，如果我们要研究肿瘤发生的机制，研究这些差异表达的基因是必不可少的。
利用在线工具GEO2R寻找差异表达的基因
那么这里，小编给大家介绍一个简单且容易上手的在线工具——GEO2R。同样，我们根据上一讲给的网站点击进入（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），我们输入gastric cancer,回车。
然后点击第一项，进入下面这个界面。
再点击GSE27411，进入以下界面。
然后点击Analyze with GEO2R。
点击Define groups，这里我们假设分为两组，分别是infected和uninfected。首先我们先输入infected，然后回车。接着再输入uninfected, 回车。完成后显示如下。
接下去我们可以看到下方有一个表格，其中前4行是unifected，接下去6行是infected。这里先点击第一行，条带会显示黄色，然后再点击Define groups里的uninfected，完成后原本黄色的条带会显示为粉红色，如下图。
依次类推。。。
分类完成后，鼠标往下滑，点击Top 250，最后界面显示如下。
操作到现在，其实寻找差异基因的步骤已经基本结束了，但是大家或许对这个表格的解读还是存在疑惑，接下去，大家跟着小编一起来解读一下这个表格的具体内容。
这里，所有基因的排序是根据P.Val值从小到大依次排列的，P值越小，越有理由相信该基因在组与组之间存在差异表达，而adj.P.Val是经过校正后的P值，其意义与P值一样，但更加准确。B是经过bayes调整后得到的标准差的对数值，t是经调整后，所要比较的两组表达值经T检验后的t值。logFC指的是两组表达量间以2为底对数化的变化倍数。这么几个指标中，最最重要的是adj.P.val和logFC。至于结果的保存，经过小编个人操作后，建议直接在表格上选定，复制黏贴到excel。不过，界面中有一个save all results，点进去后如下图。
如果你从上图中选定后复制黏贴到excel中，你会发现所有数据都集中在一个格子中，而不是每个数据都落在各自的格子里。比较不方便后续的数据处理。
最后提一点，在之前的那张表格里，仔细的同学会看到有些个别几行没有gene.symbol，如下图。
这是为什么呢？道理很简单，人类转录组有很多成分，除了我们平时讲的mRNA,还有非编码RNA，假基因RNA，核糖体RNA等等。基因芯片检测的时候，都会涉及到这些RNA，但他们中间有些要么不是基因，要么功能还没明确，甚至未被命名，所以一般在分析的时候都会把这些没有symbol的探针直接滤过就可以了。
如何应用GEO2R的在线工具来帮助寻找差异基因
今天小编再教大家一招，如何使用gene spring来再次实现这个功能。那么我们打开上一节最后生成的界面，如图。
接下去我们先要对所有的样本进行分组，只有分了组，才能进行比较。首先我们点击右上角的Experiment grouping，然后选择Add Parameter。
这里Parameter name中我们命名为group，参数类型选择非数值型。
现在总共有32个样本，假设我们分为两组，分别为control和drug。先选择前16个样本，然后点击Assign value，出现对话框后我们命名为control。
同样道理，我们用同样的方法给后16组命名为drug。如图，点击OK。
接着我们点击右上方的Create interpretation，这里我们选择非连续性。接下去几步都默认即可。
接着我们点击下图中红色圈的statistical analysis, 进行统计分析。
这里我们选择非配对T检验，具体需要根据每个实验的具体情况而定。
在这块我们假设，如果两组样本之间基因差异要有统计学意义，则p<0.05。当然如果最后发现差异基因有很多，你可以把p控制在小于0.01。
这里你可以发现有833个基因存在表达差异。其他默认。
之前我们筛选出来的都是有表达差异的基因，接下去我们要挖掘这些基因彼此间差异到底有多大呢，这个值是我们可以人为设定的。那接下去我们需要点击右侧的fold change，如图。
这一步我们默认。
这个对话框里我们选择Pairs of conditions。
同样这里我们把差异控制在2倍以上。
最后发现只剩下3个基因。其他步骤我们均默认。
你会发现这3个基因均是表达下调的。
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