基因表达调控研究是分子生物学研究热点之一，而细胞这个「娇贵」的载体，在和它相处的过程中可谓是步步惊心。
小师妹
师兄，上次你教过的养细胞妙招太好使了，我已经准备做基因敲除细胞系了！
不错啊，那你知道哪些细胞可以进行基因编辑？又如何确保细胞敲除成功吗？你知道 CAS9 基因敲除的技术原理、路线和优势吗？
师兄
小师妹
舞台交给你，你说你说。
下面让我们进入经验分享环节：
经验分享
首先是 Cas9 基因敲除细胞系的技术原理：
CRISPR/Cas9 系统工作原理是 crRNA 通过碱基配对与 tracrRNA 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 RNA。
通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的 sgRNA，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割，引起 DNA 双链断裂。
利用体内非同源末端修复机制（NHEJ）或同源重组机制（HDR）修复 DNA，出现碱基插入、缺失、替换等，引起基因移码突变、致使基因功能丧失。
其次是构建 Cas9 基因敲除细胞系的技术路线：
从设计 sgRNA、构建 sgRNA 表达载体、细胞转染、流式分选及单细胞铺板培养、筛选单克隆、单克隆鉴定及阳性细胞扩培提交等实验过程，相对来说实验步骤比较多，实验要求非常精细，真的是「一着不慎，满板皆错」。
小师妹
那么到底什么细胞适合呢？
不要急，下面就说说常用的细胞和应用领域。
师兄
常用细胞及应用领域：
常规培养细胞，根据细胞生长特性分类，无外乎贴壁生长细胞和悬浮生长细胞两大类。
能稳定传代、易培养的细胞都适合基因编辑，贴壁细胞的基因编辑好操作些，但是悬浮细胞相对更难些，难在细胞转染和挑单克隆这两方面。）比如常见的 293T、Hela、231、Hep2、A549、AML12、T24、U937、THP1 等等细胞。
另外，未来我们会在干细胞、神经元细胞等难编辑细胞有所突破，并广泛用到点突变细胞系、基因过表达系、基因沉默细胞系、细胞功能等实验。
Cas9 基因敲除细胞系的技术的应用领域：
别以为这个是一个不常见的技术，其实在人类蛋白和疾病研究院所、综合大学生物专业、医学院及附属医院——生理、病理、免疫、发育、细胞等等都已经用到了，甚至几乎所有生物研究有关行业，农科、分子生物学、生物公司都在广泛采用。
最核心的研究领域，当然还是我们最熟悉的以下研究：
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基因功能基础研究
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疾病机理研究
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药物筛选及药物毒理学研究等
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基因表达调控研究
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表观遗传学（甲基化等）研究
小师妹
等等，你之前说有一个确保成功的方法？
是的，不过这么关键的内容我先透露一点点。
师兄
具体操作：
主要是 3 种准备（单克隆、Pool 鉴定、FACS 分选后细胞冻存）。
当然，对于我们来讲其实有一个更好的选择，刚刚我说的全部敲除成功的细胞以及应用都是来自邦耀生物的成功案例，邦耀的几大优势，才是保证细胞敲除成功的最大因素：
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超一流的实验平台
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多细胞种类：贴壁细胞和悬浮细胞
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一站式体验：从 sgRNA 设计、表达载体构建至单克隆细胞鉴定等
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高准确率：敲除效率高，且脱靶效率低
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优质售后服务：售前售后技术支持
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实验周期短：最短 2 个月提交
文章来源：上海邦耀
图片来源：上海邦耀
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