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2022
04-07

科普 | 靶向和非靶向性代谢组学分析技术简介

代谢组学(Metabolomics)是生物体内生化反应的总成,是生命体维持生命的物质基础,也是研究生命活动的重要基础。代谢组学是基于高通量分析和生物信息学技术,研究生命在内、外环境影响下的内源代谢活动,包括对代谢产物种类、数量及其变化规律的检测和分析,从而研究集体生命活动发生和发展的本质。代谢物作为生物学过程的终端产物,其状态改变能够准确地反应细胞功能的变化。研究表明,包括癌症在内的多种疾病,如肝脏疾病、肾病、心血管和神经系统疾病等都与细胞内代谢状态改变导致的生理学紊乱或细胞功能缺失相关联。代谢组学已成为后基因组学时代功能基因组学的研究利器,是大规模筛选用于疾病的早期预测、诊断和分型的新生物标志物的重要手段,是精准医学的重要技术手段之一。

代谢组学优势

  • 代谢物的种类、数量变化易于检测;
  • 相比于基因组学和蛋白组学,技术手段更为简单;
  • 与基因组学和的蛋白组学相比,代谢物数量少,易于检测、验证和分析;
  • 代谢水平变化可实时揭示机体生理病理状态。

代谢组学分类

代谢组学根据研究目的的不同,可进一步分为非靶向和靶向代谢组学。

非靶向代谢组学(Untargeted Metabolomics)是指采用 LC-MS、GC-MS、NMR技术,无偏向性的检测细胞、组织、器官或者生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物(主要是相对分子量1000 Da以内的内源性小分子化合物) 的动态变化,并通过生信分析筛选差异代谢物,对差异代谢物进行通路分析,揭示其变化的生理机制。

靶向代谢组学(Targeted Metabolomics)是针对特定一类代谢物的研究分析。二者各有优缺点,经常结合使用,用于差异代谢产物的发现和定量,对后续代谢分子标志物进行深入的研究和分析,这在食品鉴定、疾病研究、动物模型验证、生物标志物发现、疾病诊断、药物研发、药物筛选、药物评估、临床研究、植物代谢研究、微生物代谢研究中发挥重要作用。

代谢组学应用方向

1、生物样本中复杂代谢产物的检测。

2、寻找疾病的生物标志物。

3、标志物的验证和绝对定量研究。

4、研究代谢通路机制。

靶向代谢组学和非靶向代谢组学区别

代谢组平台比较

非靶向代谢组学常用LC/MS、GC/MS、NMR三种检测手段,优缺点如下表:

1. NMR(核磁共振)

优点是对样品无破坏性,测定无偏向性,即适用于血液、尿液体液等液体样品,也适用于组织和器官等固体样品,并且测定速度快,可实现样品代谢组的动态监测,缺点主要是分辨率较低。

2. GC-MS(气相色谱)

GC-MS是代谢组学研究的技术,具有技术成熟稳定、分辨率高等特点,同时,由于具有相对完善的数据库,使得定性也好一些,缺点则主要表现在样品处理复杂,并且对于不易衍生化的物质定性和定量较困难,影响了该技术在更大范围内的使用。

3. LC-MS(液相色谱)

优点主要表现在样品制备和前处理简单、实验重复性好,分辨率高,分离和分析范围大,缺点则主要表现在数据库完善程度不够,定性相对困难。

各平台优缺点比较

数据平台

非靶向代谢组学实验流程

非靶向性代谢组学分析技术

代谢组学常常需要运用多种分析技术手段来满足不同的实验需求。常见的代谢组学分析技术包括核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、毛细管电泳-质谱联用(CD-MS)、HILIC--MS等。高分辨质谱技术主要有TOF-MS、FTICR-MS、Orbitrap-MS、Sector-MS等。

技术平台敏感性比较

1. GC-MS(气相色谱)是代谢组学研究的经典技术,具有技术成熟稳定、分辨率高等特点,同时,由于具有相对完善的数据库,使得定性也更为准确,缺点则主要表现在样品处理复杂,并且对于不易衍生化的物质定性和定量较困难,影响了该技术在更大范围内的应用。

2. LC-MS(液相色谱)优势主要表现在样品制备和前处理简单、实验重复性好,分辨率高,分离和分析范围广,缺点则主要表现在数据库完善程度不够,定性相对困难。

数据分析

  • 数据预处理:利用XCMS、MZmine和MarkerView等工具进行原始数据处理。
  • 鉴定差异代谢物:常用的分析方法包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等。数据分析结果还需要经过t检验和变量权重重要性排序(variable importance in projection, VIP)值筛选差异性代谢产物。一般认为,同时满足P<0.05,VIP>1.0的变量为差异代谢物。
  • 代谢通路分析:常见的代谢组学通路数据库包括HMDB、KEGG、Reactome、BioCyc、MetaCyc等数据库,可以利用这些数据库进行代谢通路和互作网络分析。
  • 多组学分析:多组学分析已经是组学发现的趋势了。可用的数据库和工具包括IMPaLA网站、iPEAP软件、MetaboAnalyst网站、SAMNetWeb网站、pwOMICS、MetaMapR、MetScape、Grinn、WGCNA、MixOmic、DiffCorr、qpgraph、huge等。

非靶向代谢组分析流程图

非靶向代谢组学研究流程

基于非靶向代谢组学的代谢性疾病转化医学研究流程 (图片来自张涛实验室)

关于样品

1. 微生物和细胞样本:迅速钝化代谢活动(淬灭),同时保持细胞不裂解

2. 动物体液(如尿、血、组织、器官、唾液):采样后要迅速预处理,如加入抗凝血剂、防腐剂,并立即冷冻处理(-80℃)

3. 植物样本:采集后迅速冷冻(液氮),然后转入-80℃保存,200mg/例

4. 血清样品:500ul/例(不得低于200ul/例),一定避免反复冻融。(血液收集在离心管中静置30分钟进行凝固。然后离心取上清装载于干净的离心管中,再离心5分钟,8000rpm,取上清分装到冻存管中,每管0.5ml,-80℃冻存寄送。)

5. 尿液样品:1ml/例,原则上可以多取一点(尿液直接分装到离心管中,每管1ml,添加一滴(约10ul)质量体积为1/100(w/v)的叠氮化钠,-80℃冻存寄送)

6.瘤胃液:1ml/例,原则上可以多取一点。 收集步骤:瘤胃液经 6000×g 离心15min,取上清,分装, -80℃冷冻保存,干冰寄送。 为了让样品能保存更长的时间,取样之后可添加一滴(约10µl)质量体积为1/100(w/v)的叠氮化钠溶液。

样本要求

友情提醒

关于生物学重复次数

一般来说,植物、细胞、微生物等至少6个生物学重复,动物样本,由于其个体化差异较大,包括组织、血、尿液等至少10个生物学重复。临床样本,个体差异更大,血浆、尿液等至少要在30个生物学重复左右,无上限。具体根据文章发表档次和实验设计而定。

参考文献

1.Poisson, L.M., et al., Untargeted Plasma Metabolomics Identifies Endogenous Metabolite with Drug-like Properties in Chronic Animal Model of Multiple Sclerosis. J Biol Chem, 2015. 290(52): p. 30697-712.

2.Fan Y, Li Y, Chen Y et al., Comprehensive Metabolomic Characterization of Coronary Artery Diseases. J Am Coll Cardiol. 2016; 68(12):1281-93. doi: 10.1016/j.jacc.2016.06.044.

3.范仕成,高悦,张慧贞,黄民,毕惠嫦.非靶向和靶向代谢组学在药物靶点发现中的应用[J].药学进展,2017,41(04):263-269.

4.赖博文,刘玢,梁永康.基于高分辨质谱的非靶向代谢组学在食品造假鉴定中的研究进展[J].生物技术通报,2019,35(02):192-197.

转自:基因狐

最后编辑:
作者:萌小白
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