福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本自诞生以来，凭借着保存时间长、可关联临床及多组学数据等诸多优点，是生物技术研究、药物发现和回顾性基因研究的宝贵资源。不过令人遗憾的是，FFPE样本目前在单细胞研究中的使用却非常少，组学检测项目也相当有限，究其原因是FFPE处理使得样本中的RNA质量下降且存在片段化，所以难以准确评估转录本的表达。为突破这一壁垒，10x Genomics 经过不断优化和探索，在今年率先推出了Fixed-RNA实验方案，其技术核心是使用探针杂交的方法锁定RNA的表达状态，针对FFPE样本不仅能实现单细胞水平上的研究，而且还能获得高度敏感、特异且可重现的转录组数据，这就意味着可以为研究者们解锁大量储存在生物样本库上的宝贵信息，在未来的转化和临床研究方面具有重要意义。本期就来带大家简单了解一下FFPE样本单细胞测序的原理以及其最新的研究进展。

实验原理

在Fixed-RNA实验方案使用的Fixed-RNA Profiling 试剂盒中，针对靶mRNA设计了两段连续的特异性探针，覆盖人的18000个基因和小鼠的20000个基因，探针对的数量共55000种，一般每个基因包含三个探针对，而对于一些表达丰度特别高的基因设计了一个探针对。在每个探针对中，LHS（左端探针）包含有read 2结构，RHS（右端探针）包含有Probe Barcode和Partial Capture Sequence 1（pCS1）结构，Probe Barcode（共16种）用于区分样本来源，pCS1可以与10x Gel Beads上的Oligo序列进行连接。探针被杂交后，只有靶mRNA的两段连续探针同时被杂交，探针才会进行连接，若只有一段被捕获，后续将无法完成建库，有效降低假阳性。之后mRNA模板彻底降解掉，成对的探针从细胞核出来，在单个油包水结构中被Gel Beads上包含barcode、UMI和pCS1序列的引物序列捕获，最后携带barcode的探针序列用于进行文库构建和测序（如下图所示）。

初步结果

针对这个方法，10x Genomics团队使用了25μm-100μm的33个人的FFPE组织切片来进行单细胞FFPE测序的测试，切片的储存年限从1年到19年不等，其中有23个样本产生了高质量的数据，不过总体数据的质量会随着FFPE样本质量和组织年限而变化，在一般情况下，储存超过10年的组织将不太可能产生高质量数据。

随后10x 团队也把这个方法用于对单一FFPE 样本的研究中。在今年的 AGBT 大会上，10x 团队向我们展示了使用浸润性导管癌的FFPE样本进行固定后进行单细胞转录组测序的初步数据。实验得到了 13 种细胞类型（含 1 种未知细胞类型），同时也从该 FFPE 样本中也检测到了多种免疫细胞。浸润性导管癌是乳腺癌最常见的病理类型，而乳腺癌是一种多病理类型的复杂疾病，每个肿瘤亚型具有独特的特征和显著的细胞和分子异质性。通过单细胞 FFPE 测序，可以将得到的基因特征应用于该数据集中的每种细胞簇。之前仅有文献对新鲜样品进行过此类分析，但在FFPE样本的数据上发现这一点，可以使研究人员将其应用于大量生物库FFPE 样本，解锁更多存档样本。

浸润性导管癌 FFPE 组织的单细胞分析

通过标志基因的表达情况，还能够看到细胞增殖以及耗竭性 T 细胞

将每个细胞簇与 PAM50 基因特征相关联，实际上只有一个编号为 17 的细胞簇与癌症亚型显示出强相关性，而其他细胞簇与正常特征相关

研究进展

近日，10x 团队在bioRxiv上发表了题为High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue的文章（https://doi.org/10.1101/2022.10.06.510405）文章中，研究团队利用该导管癌的FFPE样本进行了更为深入的研究。

单细胞FFPE解决方案10x Genomics现有的3'基因表达和5'基因表达方案的基因中位数检测灵敏度

值得一提的是，为了进一步测试单细胞FFPE测序新技术的表现，文章中使用Chromium系列单细胞技术和新鲜样本进行比较。通过中位基因表达量来表征上述各技术的定量敏感性。当不同平台的测序深度保持不变时（每个细胞约10,000个reads）时，基于10x Genomics全新的Fixed-RNA技术的单细胞FFPE解决方案的基因中位数检测灵敏度要高于10x Genomics现有的3'基因表达和5'基因表达。

单细胞FFPE测序和Visium CytAssist数据展示了FFPE组织空间背景的完整转录组信息

此外，文章还展示了三种FFPE样本兼容检测方法，其中单细胞FFPE测序是唯一一种以单细胞分辨率提供全转录组数据的方法，这使其非常适合于建立疾病基线、注释细胞类型以及设计或验证靶向Xenium基因组合。与单细胞FFPE测序一样，Visium也提供了全转录组数据。由于两种技术使用相同的探针集，因此将单细胞FFPE测序和Visium数据整合起来简单方便，这为后续组学的整合创造了有利的条件。随着基础研究和分子生物学相关技术的不断发展，单细胞FFPE测序在未来将会与不同的技术结合，为我们解锁更丰富的生物学信息，在肿瘤微环境、细胞特异性、生物发育等领域的研究中带来一场全新的改变。