FFPE样本制备及分析（上篇）| 实验技术专题

肿瘤组织是几乎唯一一种病人愿意让医生切下来的组织，医生对这些组织进行回顾性研究，有助于阐明疾病机制，发现治疗靶标和指示预后恢复。但离体的组织容易丧失原有正常的结构和功能，一般医院没有太好的超低温冷藏条件，而使用福尔马林固定石蜡包埋处理的样本（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE）可以在常温保留很久，所以对肿瘤组织进行石蜡包埋保存就成了医院里最常用的样本储存手段。

据估计，这世界上大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中。其中绝大多数是石蜡包埋的样品。数量巨大的样品蕴含着无限的科学研究的机会，同时也是研究者们很棘手的研究对象。

随着精准医疗对病理科的影响渗透，以及研究手段的不断升级，病理医生除了关注传统组织形态以外，对积攒了百年之久的FFPE样本在分子层面的研究也越来越多，大部分样本主要与肿瘤相关，所以研究这些组织样本为探讨新的肿瘤分类、诊断和预后标准，开发肿瘤早期检测的实验技术、转化医学和个体化医学提供了有利的依据。

福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响，从石蜡切片中提取出高质量基因组，并构建出信息完整、无偏好、可用于后续各类组学研究的文库，则是“大大”的难题。

本文对FFPE样本制备、核酸提取和分析步骤进行阐述，以求获得高质量的DNA和RNA进行下游实验。

FFPE样本制备、提取及分析流程如下:

一. 样本制备

1.样本采集

每种组织都有其特定的生理功能，并就其结构和组成细胞而言是独特的。取决于组织类型，收获后生物分子降解、诱导或修饰的速度可能各异。从病人身上获得组织标本的手术涉及麻醉、血管结扎、组织的切除以及固定。从病人麻醉到组织固定这段时间内，组织中的基因表达可能发生变化，且可能发生组织自溶。因此，组织固定前的操作时间应当越短越好，以避免RNA转录本和蛋白表达谱发生明显改变。在处理肿瘤组织时，应当注意健康和恶性细胞并不是均匀分布的。因此，同一个组织样品中一块切片的分析结果可能与另一块切片不同。

2.福尔马林固定

组织的固定是将标本放在福尔马林溶液中，此溶液的组分可能有所差异（典型的10%福尔马林溶液可能含有3.7% 甲醛以及1-1.5% 甲醇）。产生的化学反应导致生物分子之间的交联，包括核酸之间、蛋白之间，以及核酸和蛋白之间的交联。为了获得最佳的结果，应当使用中性的福尔马林缓冲溶液，以取代无缓冲或酸性的溶液。中性缓冲液减缓福尔马林的降解，而通常认为其降解产物会损害核酸的质量(图1)。

图1. 福尔马林固定对DNA、RNA和蛋白的影响。

福尔马林固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。固定时间越长，交联程度越大。

福尔马林大约以1 mm/小时的速率渗透组织。此外，福尔马林的渗透速率随组织厚度的增加而降低。因此，在固定一个组织标本时，它应当足够薄，以避免周边的过度固定和中间的固定不足。固定不足（underfixation）可导致组织标本中福尔马林未渗入的较深区域的核酸和蛋白降解，或基因表达发生改变。过度固定（overfixation）则导致更密集的交联，让有用核酸和蛋白的提取变得更加困难。在固定整个组织（厚度大约1 cm），而不是组织切片（厚度约4 mm或以下）时，RNA显著降解（图2）。为了获得最佳的结果，通常建议固定最多5 mm厚的组织标本。

图2. 样品厚度对RNA完整性的影响

大鼠组织以整个器官或≤4 mm的切片进行福尔马林固定和石蜡包埋。A 包埋后3天利用RNeasy® FFPE Kit 纯化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。在整个大脑的电泳峰图中，双箭头指出了18S rRNA和28S rRNA的峰减少，表明RNA片段化的增加。B 纯化的RNA被用于一步法RT-PCR中，利用大鼠Rpl4基因特异的不同引物对和QIAGEN OneStep RT-PCR Kit。从左到右，扩增子大小分别为96、206、400、613和785个核苷酸。整个器官的分析中较大扩增子的缺失表明较大的RNA存在降解。（von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）

福尔马林与组织的比例至少应为10:1，以确保最佳的固定。在处理小的组织标本，如穿刺活检时，这很容易实现。然而，在处理大的组织样品时，固定所用的福尔马林可能不足。在这种情况下，组织切片应当切割后再进行福尔马林固定。

组织的固定不应超过24小时，以避免过度固定。在一个比较过夜固定和72小时固定的实验中， 72小时固定对纯化后RNA在一步法RT-PCR中的表现有不利影响：较大的扩增子无法成功扩增，这极有可能是因为RNA分子的过度交联和较高比例的不可逆交联（图3）。

图3. 固定时间对RNA完整性和一步法RT-PCR的影响

各种大鼠组织经过福尔马林固定（过夜或3天）和石蜡包埋。大鼠组织以RNAlater® RNA Stabilization Reagent稳定。包埋后3天利用RNeasy® FFPE Kit纯化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。此外，利用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit和大鼠Rpl4基因特异的引物对开展一步法RT-PCR。扩增子大小如图所示，RT-PCR的结果以颜色显示：红色表示无扩增；黄色表示弱的扩增；绿色表示成功的扩增。尽管较长时间的固定对RNA片段化和核糖体条带影响甚微，但较长扩增子的扩增效率差。（von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）

3.石蜡包埋

在福尔马林固定之后，组织标本包埋在石蜡中，此过程包含几步。第一步是脱水，其中水被替换成醇类，通常为乙醇。接着是透明，其中醇类被替换成二甲苯或二甲苯替代物，之后是浸蜡，其中二甲苯被置换成石蜡。最后一步是包埋，整个标本被石蜡包围。在浸蜡之前，组织标本必须完全脱水，因为残留的水分可能导致样品降解。石蜡包埋是维持蛋白完整性的关键一步，因为残留的水分可能导致蛋白水解。因此，应当使用未经水稀释的高质量试剂，且整个包埋过程的持续时间和温度应当优化，以实现彻底的脱水。建议使用新鲜的醇类和二甲苯，以避免过去使用时水分残留的可能。

浸蜡和包埋福尔马林固定组织中使用的石蜡的熔解温度和组分可能各异。在使用熔解温度高的石蜡时，包埋过程需要较高的温度，这可能导致样品降解增加。为了确保从FFPE样品中可用核酸和蛋白的理想回收，应当使用熔解温度低的石蜡。此外，应当避免包含添加剂如蜂蜡的石蜡，因为它们可能干扰生物分子的回收。

在固定和包埋之后，FFPE样品最好应在最佳温度下保存，这样可减缓核酸和蛋白的降解。在一个比较不同保存温度的实验中，QIAGEN的科学家发现，如果FFPE样品保存在4°C，而不是室温或更高，则RNA在1年后仍基本完整（图4）。

图4. 保存温度对RNA完整性的影响

各种大鼠组织经福尔马林固定和石蜡包埋。在包埋后3天（T0）或在4°C、20-25°C或37°C保存一年后利用RNeasy FFPE Kit纯化RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析RNA完整性。对于保存在4°C的样品，18S rRNA和28S rRNA对应的峰清晰可见，表明存在完整RNA，而保存在较高温度下的样品却并非如此。（von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）

由于FFPE样品中的RNA常常严重片段化，所以对小分子RNA如microRNA（miRNA）而言，回收基本完整RNA的机会高于较长的RNA如mRNA。这意味着检测短扩增片段的分析（如特定miRNA的分析）受福尔马林固定的影响比检测长扩增子的分析（如特定mRNA转录本的分析）要小（图4）。