单细胞+空间 | 3种技术助力解锁FFPE样本中的新世界！

福尔马林固定石蜡包埋的组织样本（FFPE）作为长期保存病理样本的金标准，已经存档了大量生物样品，不过这些被存档样品却因为前期固定包埋的时候，发生了核酸片段化、蛋白与核酸交联等情况，导致其价值无法被最大程度利用。随着基础研究和分子生物学相关技术的不断发展，FFPE样本的技术局限逐渐被破解，如今不仅可以在FFPE样本上开展单细胞转录组测序和空间转录组测序研究，还能同时进行空间原位多靶标蛋白检测，这些技术将有助于揭开FFPE样本尘封已久的宝贵信息，为医学病理和机制研究、药物发现和回顾性研究带来新的发现。

FFPE样本单细胞转录组测序

单细胞技术为生物科学研究中创造了许多突破性进展，不仅解决了细胞异质性的难题，还深入解析了单个细胞的行为、机制及其与机体的关系。以往的技术一直难以在RNA降解严重的FFPE样本中获得好的检测结果。为解决这个困境，10x单细胞基因表达Flex解决方案应运而生，使用探针杂交（RTL）捕获的方法，成功对FFPE样本进行了单细胞转录组测序。

图1 浸润性导管癌10x scFFPE-seq测试结果（2022 年AGBT大会）

Flex解决方案针对靶mRNA设计了两段连续的特异性探针，覆盖人的18000个基因，小鼠的20000个基因。FFPE样本会先通过脱蜡和酶消化结合的方法制备成单细胞核悬液，然后加入探针进行杂交，只有LHS（左端探针）和RHS（右端探针）与靶mRNA的同时杂交时才会进行连接，有效降低假阳性。

图2 Flex解决方案基于探针杂交的建库原理

在RHS上，带有区分样本来源的Probe Barcode，每个样本与不同的探针进行杂交，就会带上特有的Probe Barcode，数据分析时可通过识别不同的Barcode将不同样本来源的Reads区分开，因此Flex方案也支持FFPE多样本混样测序（四混一，八混一，十六混一），极大地节约了成本。10x Genomics官网提供了不同样本混样的结果，数据表现如下：

送样要求

10x 单细胞FFPE测序也是以单细胞核悬液为原始材料，单细胞的质量是数据好坏的关键，对于提供组织有如下要求：

1.对于有暴露组织的组织块，丢弃前几个切片，开始收集后续的切片。

2.切片抽提至少需要100um，尽量保证切片完整、无破碎，放入1.5mL离心管中。

3.已切好的样本建议4度干燥存放（将已放入蜡卷的1.5mL离心管及少许干燥剂放入煲封袋（尽量排除自封袋内的空气），置于4度暂存。

4.冰袋运输送至云准实验室。RNA质控满足要求（DV200＞30%）。

FFPE样本空间转录组测序

10x平台上针对FFPE样本设计了两种空间基因表达解决方案。在标准Visium FFPE方案中，首先将FFPE组织切片放置在Visium基因表达玻片上，进行组织学成像（通过H&E染色获得形态背景），然后通过探针杂交的方式对靶mRNA进行捕获，在Visium FFPE 玻片上的每个捕获区都有一个阵列，其中含有与RNA结合的捕获探针（RTL），技术原理与上面的10x scFFPE-seq一致。探针杂交后对组织进行透化处理，以释放连接的探针对，使其与玻片上的捕获探针（UMI和Barcode）杂交，从而实现基因表达信息的捕获，用于制备测序文库（图3上）。

10x随后又推出了Visium CytAssist方案，通过CytAssist这台小型仪器，可以更简单便捷地处理和贴片，样本的兼容性也更高，组织捕获区域更大。首先，需要在普通玻片上进行 FFPE 组织切片的脱蜡、染色成像、解交联和探针杂交等过程。然后确定感兴趣的病理区域，将普通玻片和基因表达芯片放入CytAssist 仪器捕捉明场图像。接下来，通过运行CytAssist将普通玻片上的转录组信息（选定目标区域的探针）原位转移到基因表达芯片的捕获区域。在捕获区域中，通过带有不同位置标签的探针获取所研究区域的转录组信息（探针释放和捕获），从而获取石蜡切片不同空间位置的转录本的表达水平。最后，把基因表达芯片从仪器中取出，进行后续探针延伸及文库构建（图3 下）。

图3 标准的Visium FFPE流程 VS Visium CytAssist的FFPE流程

目前，云准已经使用Visium CytAssist方案完成了多个人和小鼠FFPE样本的空间转录组检测，这个方案能获得更加准确的空间信息，也更推荐大家使用，以下是部分样本实验结果展示：

送样要求以及对比

* 石蜡块需放置于包埋盒内，注意防撞，冰袋快递，3日内送达。

* 使用Visium CytAssist方案的石蜡切片组织区域必须在如下图的白色区域中：

FFPE样本空间原位蛋白检测分析

基于Akoya平台的高通量免疫荧光定量分析是一种简单且全面的空间蛋白组验证技术，集合了免疫荧光、免疫组化和原位杂交的特点，以酪胺信号放大（TSA）为技术基础，在同一张切片上显色多个标靶，通过不同颜色来共定位蛋白质的表达，这种方法不受抗体种属的限制，具有空间定位以及定性定量分析的双重优势。

图4 高通量免疫荧光定量分析TSA技术

另外如果需要检测更多的蛋白靶标，则可以通过Akoya 单细胞原位空间组学分析技术进行分析。其原理是每种抗体上标记特异性寡核苷酸条形码标签(Barcode), 荧光上也会带一段特异性的寡核苷酸序列。抗体和荧光染料通过特异性的Barcode序列相互识别。带有不同特异性Barcode的几十种抗体在混合后，同时与组织进行孵育。抗体在组织切片上充分结合了各自对应的抗原靶标，然后在仪器种进行自动化染色，每次加3种荧光，荧光上的寡核苷酸序列可以和抗体上的Barcode特异性识别，然后进行成像，洗脱荧光，接着再进行下一轮染色，成像，洗脱，循环往复。这样就可以突破可见光谱荧光成像通道数量的限制，轻松实现几十种甚至100+种蛋白指标的同时检测及分析。