三代全长16S扩增子测序

1.产品简介

 

图1：微生物多样性测序分类

1.2三代全长16S扩增子测序
二代16S，由于读长相对较短，只能从9个可变区中选择基因的部分区域（如V3-V4区域、V4区域等）测序，较难区分种水平物种。随着测序技术的发展，三代测序技术被应用到16S扩增子测序中。康圣序源基于PacBio Revio测序平台的三代全长16S测序技术，读长更长，覆盖V1-V9区域，可直接获得16S全长序列，突破了二代16S测序读长短的局限性，实现低丰度的物种检测、提高物种注释准确性和分辨率。

图2.16s rDNA全长(~1500bp)

1.3技术原理（PacBio Kinnex 16S rRNA试剂盒）

PacBio推出的Kinnex 16S rRNA试剂盒，提高了微生物测序通量。该试剂盒采用MAS-Seq技术，利用较长的HiFi读长，将多个全长16S扩增子串联成更长的单分子长片段，大幅度提升全长16S的测序通量。该试剂盒在Revio系统上，每张SMRT cell芯片上可产生60M Reads，与旧试剂盒相比，其通量提高了12倍。同时，新试剂盒最大可支持1536个混样测序。

图3：Kinnex 16S rRNA试剂盒建库原理（图来自PacBio官方文档）

1.4实验流程
提取样品总DNA后，根据全长引物序列合成带有Barcode的特异引物，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRT Bell），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用 PacBio平台进行测序，并进行后续数据分析。

2.应用领域

Ø  鉴定环境样品中微生物在门、纲、目、科、属、种水平的分类；

Ø  检测环境样品中微生物在各分类水平上所占的相对比例即丰度；

Ø  比较不同处理样品中微生物群落结构的差异，各样品中优势菌种；

Ø  探索微生物群落和环境因子之间的相关关系。

3.技术路线

4.三代全长16S产品优势

1.长读长：三代16S测序跨越16S rRNA基因的全长序列，读长能达到15kb~20kb或更长的读长；而二代16S测序只覆盖部分可变区域，读长只能达到150~500bp。

图4.基于PacBio Revio测序平台进行的三代16S测序的reads长度分布图。

2.更高的“种”水平注释率：三代全长16S测序可以覆盖V1-V9全长区域，实现“种”水平物种注释，且“种”级别物种注释率高；而二代16S测序仅能实现“属”水平物种注释，且属、种水平的未鉴定物种比例高。

图5. 二代16s与三代全长16s未鉴定物种占比结果对比（图片引自文献【1】）

3.高准确度：PacBio HiFi、Illumina以及ONT的测序准确性测试，发现基于PacBio HiFi测序的准确性高达99%以上，明显高于Illumina和ONT。

图6：PacBio HiFi、Illumina以及ONT测序准确性比较（图片引自PacBio官方）

4.高通量低成本：Revio系统支持60M SMRT cell，一张测序芯片上的零模波导孔（ZMW）提升至2500万个，其通量提高了12倍，且支持混样测序，大大降低了测序成本。

5.结果展示

康圣序源基于PacBio Revio测序平台以及Kinnex 16S rRNA试剂盒，混测275个样本进行三代全长16S测序。数据产出102.58G，HiFi Reads数5.48M。

表1：CCS数据统计

图7：测序准确性分布                                       图8：HiFi reads长度分布

2.文库串联连接效率：

本次项目将串联结构切割后共计得到64 M Segmented Reads (S-Reads)，HiFi Reads平均串联结构单元11.77个，串联效率高达94.07%。

表2：S-Reads数据统计

图9：HiFi Reads串联结构单元分布

3.拆分情况

拆分到275个样本，拆分得率高达99.62%，拆分HiFi Reads数为64,302,713，平均每个样本233,828，最少样本为44,674、最大样本为657,486。

表3：文库串联数据拆分统计

其他数据展示

6.送样建议

最后编辑：2025-12-23

作者：萌小白

一个热爱网络的青年！

站内专栏 邮箱