FFPE样本制备及分析——样本提取 | 实验技术专题

上期回顾：

FFPE样本制备及分析（上篇）| 实验技术专题

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样本切片

石蜡样本在提取前需要进行切片处理，一般需要5-6个切片，一片镜检确定肿瘤细胞含量，其他进行后续提取处理。切片的薄厚程度对后续观察和提取会有一定影响。切片过厚不利于后续染色和组织学观察，而且组织脱蜡和蛋白酶消化困难增加；切片过薄易造成DNA的机械损伤，同时切片总面积的增加，其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多。

为了避免FFPE样品分子分析的问题，样品染色应尽可能避免。某些染料和试剂可能对核酸造成不利影响，特别是那些用于免疫组化染色的试剂。涉及高pH和重金属离子的染色步骤应当避免。如果样品染色是必需的，则首选甲酚紫（cresyl violet），因为它与核酸分析兼容。

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样本脱蜡

为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底的脱蜡。在此过程中，先溶解石蜡，然后去除，暴露样品，用于后续裂解缓冲液和蛋白酶K（如果合适）的处理。多种溶剂适用于脱蜡，如二甲苯、庚烷和柠檬烯等。二甲苯脱蜡不仅容易造成核酸片段化和得率低，而且对人有毒害，切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。作为溶剂法的替代，石蜡也可通过加热与FFPE样品分离：熔化后，石蜡冷却，取决于其用量，石蜡粘在管壁上，或在样品上形成一个固体层。市面上主流试剂盒是采用无毒裂解液方法脱蜡，以及Covaris的超声乳化脱蜡，纳米级别的处理使得FFPE样品彻底脱蜡和水化。

图基于AFA(adaptive focused acoustic，适应性聚焦超声)专利技术的Covaris系列仪器

采用高频率短波长的医用级别超声波，仪器与样本不进行接触，球型换能器产生超声聚焦作用于样本，能量利用率极高，方向和力度精准可控，处理重复性好。

图由于石蜡在358nm激发光下呈现蓝色自发荧光

上图颜色越深代表残留的石蜡越多，中间图表示采用超声乳化可以彻底脱蜡。

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基因组DNA的纯化

由于FFPE样品包含的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白分子交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。如果可能的话，因交联而引起的化学修饰也应当逆转，因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收，而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物。在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心，因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化。

QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit提供了一个克服交联的有效方法，此试剂盒是特别为FFPE样品的基因组DNA纯化而设计的。样品先用蛋白酶K在56°C处理1小时，这一步通过消化交联蛋白而释放DNA。接着是优化缓冲液中的90°C孵育，这个部分逆转交联：在孵育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂，且释放出的甲醛分子与受体分子结合。

尽管过度加热会导致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在90°C孵育1小时可实现可分析基因组DNA的最佳回收。数据还显示，56°C的1小时孵育加上90°C的1小时孵育使蛋白酶K过夜孵育不再成为必需。

图基因组DNA的最佳回收

大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件孵育。作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit纯化基因组DNA，并利用分光光度计确定DNA产量。与80°C孵育和56°C的过夜孵育相比，90°C孵育实现了DNA的更佳回收。

图从FFPE组织中回收可用的基因组DNA

大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件孵育。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit纯化基因组DNA，并用QuantiTect® SYBR Green PCR Kit和Pmp2基因特异的2对不同引物开展SYBR Green® 法实时定量PCR。生成的扩增子为78 bp或464 bp。90°C孵育产生的CT值比80°C孵育更低：这表明更高温的90°C孵育在逆转交联上更为有效，提供了更多有用的DNA，作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。

在2步孵育之后，DNA可利用QIAamp MinElute® 离心柱纯化：在硅胶模上分离DNA，洗涤以去除污染，之后以20-100 μl的小体积洗脱。另外，当DNA与硅胶模结合之前，也可开展样品的RNase A消化。如果DNA的下游应用对RNA污染敏感，则需要这一步。如果纯化的DNA需要通过分光光度计定量，也需要RNase A消化，因为RNA污染也会贡献吸光值读数，导致DNA产量的过高估计。