三类BSA方法经典文献分享 | BSA专题（二）

一. 常规BSA

QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations（The Plant Journal）

BSA（Bulk segregation analysis）进行数量性状基因定位的方法由来已久，但是将高通量测序应用在BSA上则是近年来才出现的方法。这篇水稻的文章是首次将高通量测序应用在BSA分析上的尝试，之后进行的常规BSA测序基本沿用该文献提供的方法。

本文创新地将高通量测序和传统的BSA方法结合在一起，并且对分析方法进行了详细的描述。

使用两个性状差异较大的亲本A和B构建遗传群体（如图示为水稻植株高矮性状，构建的F2群体），由于多个数量性状位点控制植株的高矮，该性状在F2群体中呈现正态分布。从群体中选取最高的多个植株和最矮的多个植株分别提取DNA组成“高”“矮”混池，并且将两个混池分别进行高通量测序。测序完成后将测序数据比对到A亲本水稻的参考基因组上，来进行SNP-Index的计算。

SNP-Index是基于高通量测序的BSA分析中最重要的概念，简而言之是位点上与某个亲本一致的reads占总reads的比例，可以看成子代混池中某种等位基因的频率。以下图为例，10条reads覆盖了某一个核酸位点，该位点的测序深度是10。在这10条reads当中，如果有4条reads包含与参考基因组不同的碱基，则SNP-Index为0.4；如果10条reads均包含与参考序列不同的碱基，则SNP-Index为1。

将两个极端混池的SNP-Index相减得到ΔSNP-Index。通过滑窗计算染色体上各个区域的ΔSNP-Index，可以判断染色体上哪个区域最有可能包含目标位点。

图1 基于高通量测序的BSA分析示意图

研究者利用这种方法进行了水稻抗稻瘟病的性状定位。使用较抗病的Nortai和易感病的Hitomebore两个品系作为亲本，构建了重组自交系群体（RIL）。对子代群体中的个体使用稻瘟病菌处理2周，选取较抗病和易感病个体分别构成混池，进行测序。对测序数据进行SNP-Index分析，发现在6号染色体上2.39-4.39 Mb的位置ΔSNP-Index最高，最有可能包含目标性状基因。

图2 水稻抗稻瘟病性状定位结果

研究者还对水稻幼苗活力性状进行了定位。使用幼苗活力较高的Dunghan Shali和幼苗活力较低的Hitomebore品系杂交构建F2代分离群体，在种子吸胀后第14天测定幼苗高度，选取最高的多个个体与最矮的多个个体分别构建混池，并进行高通量测序。SNP-Index分析发现在3号染色体的36.21-37.31 Mb处和1号染色体的39.08-41.08 Mb处最可能包含目标性状位点。

图3 水稻幼苗活力性状定位结果

二. Mutmap

Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap（Nture Biotechnology）

Mutmap是BSA分析的一个重要变种，其基本原理也是通过构建分离群体，挑选极端性状构建混池，并通过计算SNP-Index来对目标性状位点进行定位。但是Mutmap可以针对经过化学诱变的个体进行性状定位，在对诱变得到的性状进行定位的时候更具优势。

文章对Mutmap方法以及后续分析进行了细致的描述。

将野生型植株使用甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate, EMS）进行诱变，得到包含目的性状的突变株后与野生型亲本回交，得到F1后自交产生F2代分离群体。从F2代中挑选野生型与突变型性状个体分别构建混池进行高通量测序。测序完成之后，同样是与参考基因组进行比对，并计算SNP-Index。

图4 Mutmap方法示意图

研究者利用建立的Mutmap方法对水稻叶片颜色性状进行了定位。以Hitomebore作为野生型使用EMS进行诱变，得到叶片颜色较浅的突变株Hit1917-pl1和Hit0813-pl2，并将这两株与亲本回交后分别进行了Mutmap定位。SNP-Index计算的结果将目标性状分别定位到10号染色体和1号染色体上。其中10号染色体的位置包含一个疑似目标基因OsCAO1。

图5 水稻叶片颜色突变的定位结果

研究者使用转基因方法进行了验证，分别往突变株Hit1917-pl1中转入了OsCAO1，往野生型植株中转入了敲低OsCAO1表达量的RNA干扰。往突变株Hit1917-pl1中转入OsCAO1得到的植株叶片颜色变深，野生型植株敲低OsCAO1表达量后叶片颜色变浅，验证了OsCAO1基因对水稻叶片颜色的调控作用。

图6 对OsCAO1基因功能进行的转基因验证，以及OsCAO1基因cDNA的测序峰图

三. BSR

Gene mapping via bulked segregant RNA-seq (BSR-seq)（PloS ONE）

对于BSA分析来说，关注的突变位点更多地位于基因的编码区域，而且部分物种基因间区域包含大量重复序列，对测序和分析造成干扰。在这种情形下，使用RNA测序来进行BSR分析，不失为一个更好的选择。

BSR方法构建群体、选择混池的方式与常规的BSA方法并无二致，只是把测序对象从DNA更换成了RNA。研究者对玉米的gl3基因突变株进行了BSR分析，gl3基因会影响玉米叶片上蜡质的积累。研究者将gl3基因突变株与野生型作为亲本构建了F2代分离群体，从F2代中挑选极端性状构建了2个混池，并分别进行了RNA测序。将测序数据与参考基因组比对后进行SNP识别，并使用经典贝叶斯算法计算SNP与性状连锁的概率。最后将gl3基因定位到了4号染色体上一段长为2 Mb的位置上，并在该位置找到了gl3基因，该基因编码啊一个可能的myb转录因子。

图7 玉米BSR测序定位结果

作者提到，对于BSR测序来说，在处理大基因组，尤其是那些包含大量重复序列的基因组的时候会很有优势。不仅减少了数据的冗余，也降低了测序成本。同时大量的RNA测序数据，也可以通过表达量的变化来为候选基因的筛选提供相应的证据。但是同时值得注意的是，对于一些发生在调控区域的突变，BSR测序是无能为力的，可能存在与性状关联不上的风险。所以BSR虽然是一个很有力的研究工具，但使用的时候仍然需要谨慎。