欧易BSA测序&RNA-seq助力解析类胡萝卜素对玉米籽粒质地调节作用

前言

2020年10月22日，中科院上海植物生理生态研究所/分子植物卓越中心巫永睿课题组于Nature Communications（IF：12.121）上在线发表玉米籽粒发育最新研究成果。通过对自然群体的极端表型混池测序分析（BSA测序）筛选到控制玉米硬（透明）/粉（不透明）质的主效数量性状位点Ven1（vitreous endosperm 1），Ven1编码 β-胡萝卜素羟化酶3（HYD3），进一步的功能验证结果揭示类胡萝卜素通过影响淀粉体膜的完整性调节玉米籽粒质地。该研究报道的玉米自然群体中存在β-类胡萝卜素优良等位基因，拓宽了培育高类胡萝卜素玉米品种的种质资源。

文章第一作者为王海海副研究员和黄永财博士后，巫永睿研究员为通讯作者。欧易生物提供了该项目的BSA分析及RNA-seq工作。

摘要

人们对成熟玉米籽粒中硬/粉质胚乳的形成机制知之甚少。研究者发现Ven1基因是影响硬/粉质胚乳形成的主要数量性状位点（QTL）。Ven1编码 β-胡萝卜素羟化酶3，该酶定位于淀粉体膜中调控类胡萝卜素的组成。玉米粉质自交系A619中Ven1基因的变异导致表达量极低，使非极性的β-胡萝卜素不能被羟化形成下游的极性胡萝卜素，从而使极性类胡萝卜素含量减少，非极性类胡萝卜素含量增加；这使玉米籽粒成熟脱水过程中，淀粉体膜的稳定性增加而不容易被降解并伴随着脂质含量的增加和组分变化。这些改变阻碍了蛋白体（PBs）的聚集，并且阻止它们与淀粉粒（SGs）的互作，从而产生排布疏松的蛋白体-淀粉体结构，透光性下降，最终导致粉质胚乳的表型。另外发现自然群体中存在 Ven1A619 的修饰因子，这些硬质材料中同时维持高的β-类胡萝卜素水平。这项研究不仅揭示了玉米硬质胚乳形成的新机制，同时为培育含高维生素A的硬质玉米新种质提供了思路。

研究背景

玉米籽粒质地是一个重要的农艺性状，由胚乳外侧透光的硬质胚乳与胚乳中心不透光的粉质胚乳的比例决定。透光的硬质胚乳可增强籽粒硬度，保护籽粒在收割和运输过程中免受机械损伤；而不透光的粉质胚乳易碎，而且易受病虫害的影响。含有较多硬质胚乳的玉米籽粒的容重较高，浮选指数较低，对玉米相关的食品加工也有很重要的影响。玉米硬/粉胚乳的形成机制一直存在许多假说，但仍然不清楚。已经发现的影响玉米蛋白和淀粉合成的大量突变，为透明胚乳的形成机制提供了较深入的研究和了解。玉米自交系的籽粒质地方面存在大量自然变异，从几乎完全硬质（完全透明）到完全粉质（完全不透明）；然而自然群体中控制硬/粉质胚乳形成的数量性状位点及其代谢产物仍知之甚少。

巫永睿研究组用玉米经典的硬质自交系W64A和粉质自交系A619杂交，并用A619作为轮回亲本，构建了近等基因系群体。经过连续8代的回交获得A619背景含有硬质QTL的硬质近等基因系NILW64A，以及不含硬质QTL的粉质近等基因系NILA619。然后通过极端表型混池测序分析（BSA测序）、图位克隆、RNA-seq数据及RNAi遗传验证克隆到这个硬质QTL，Ven1。进一步研究发现，Ven1通过调节类萝卜素的含量和组分影响玉米籽粒质地：高水平的非极性胡萝卜素（主要是β-胡萝卜素）似乎可以阻止种子成熟脱水过程中淀粉体膜的破裂并影响胚乳细胞中脂质的含量和组成；这打乱了SGs和PBs之间的互作，形成PB-SG排布疏松含有空隙胚乳，最终导致不透光的粉质表型。

研究结果

1.Ven1是控制玉米籽粒质地的主要QTL

玉米自交系W64A和A619的胚乳透明度存在差异，W64A籽粒含有80%的透明硬质胚乳，而A619籽粒中只有20%。用A619与W64A和另外两个硬质自交系（D1051和P25）进行正反交，发现所有的F1代都是硬质，表明负责A619（ Ven1A619 ）不透明粉质胚乳表型的QTL（Ven1）是隐性的。为了克隆Ven1基因，研究人员通过不断回交构建近等基因遗传群体，将显性的Ven1W64A等位基因导入A619背景中。前两轮的回交群体（F1BC1和F1BC2）没有表现出硬/粉质性状的分离；直到第三代中籽粒出现了透明、不透明及中间型的表型；F1BC5则出现了清晰的透明质与不透明质表型等比例分离。利用回交第七代F1（F1BC7）的透明质和不透明质种子各自分别自交两代，最终构建成两个纯合的近等基因系（NILs）：硬质的NILW64A和粉质的NILA619（图1a-d）。

利用F1BC5群体分离的硬质和粉质种子分别构建了极端表型混池并进行BSA测序与分析，将候选区域定位到10号染色体上；再利用F1BC7群体的2000个个体，通过精细定位将候选区域缩小到0.2Mb，该区域包含5个基因。结合亲本和近等基因系胚乳的RNA-seq数据发现只有一个基因（Zm00001d026056）在W64A、NILW64A、A619和NILA619中差异表达。对该基因进行克隆，发现A619自交系中该基因在3’端有1.25kb的缺失，导致Ven1A619 9蛋白被截断。通过功能分析与RNAi遗传验证，最终证实Ven1是控制硬/粉胚乳形成的QTL（图1e-l）。

图1 硬/粉质QTL Ven1的克隆。

2. Ven1A619 引起非极性类胡萝卜素的过量积累

qPCR分析显示Ven1基因在W64A胚乳中高表达，RNA原位杂交结果显示Ven1在从总冠到籽粒中心的淀粉型胚乳细胞中表达显著。亚细胞定位表明VEN1蛋白定位于叶绿体（质体），免疫组化检测表明VEN1的分布被限定在胚乳细胞的淀粉体被膜（图2）。Ven1编码 β-胡萝卜素羟化酶3（HYD3），与NILW64A相比，粉质NILA619胚乳中积累的非极性的类胡萝卜素类分子（HYD3上游产物）显著增加，而极性类胡萝卜素类分子（HYD3下游产物）则下降。

图2 Ven1时空表达模式及蛋白的亚细胞定位。

3. Ven1A619影响淀粉体膜的完整性和脂质组成

研究人员利用透射电镜（TEM），观察比较NILW64A和NILA619籽粒不同发育时期（18 DAP、24 DAP和35 DAP）PB和SG变化，表明Ven1A619以某种方式影响淀粉体膜的破裂，而淀粉体膜的破裂对SG-PB的互作起非常关键的作用。对授粉后24天和35天胚乳中脂质的含量和组成进行测定，发现在NIL619和NILW64A中有显著差异，与NILW64A相比，NILA619胚乳中的脂质合成能力增强。NILW64A与NILA619之间脂质组成的差异与淀粉体膜完整性的不同状态相一致（图3）。

图3 近等基因中淀粉体膜的稳定性和脂质含量变化。

4. 类胡萝卜素合成对A619粉质表型的上位效应

为进一步研究A619中非极性类胡萝卜素的过度积累是否与胚乳不透明表型有关，研究人员用EMS诱变A619的花粉，通过观察胚乳颜色来筛选类胡萝卜素合成缺陷的EMS突变体。通过BSA测序分析，鉴定了4个在胚乳颜色上表现出不同差异的单基因隐性突变，表明这些突变发生在类胡萝卜素合成的不同步骤中。这些突变体的一个共同特征是转化为透明的硬质胚乳表型（即Ven1A619的抑制子），并且lycopene, α-carotene 和 β-carotene等非极性胡萝卜素的合成在所有突变体中都受到抑制；这证实了A619胚乳中非极性类胡萝卜素的过度积累与不透明表型密切相关。同时从遗传学上支持了上游类胡萝卜素生物合成途径对Ven1A619表型的上位性（图4）。

图4 Ven1A619抑制子的筛选。

5. Ven1A619胚乳修饰因子的筛选

在VenW64A向A619周期性渗入过程中，直到F1BC3才观察到不透明表型的分离；这与NILW64A和Ven1RNAi/+的杂交不同，后者在F1代即为粉质表型，这表明W64A中存在遗传修饰因子影响不透明胚乳表型（由Ven1A619或Ven1RNAi引起）。研究人员分析了262个自交系中Ven1的基因型，发现14个Ven1A619等位基因，其中12个是透明硬质表型，只有2个粉质表型。通过将这262个自交系与Ven1RNAi/+杂交后观察籽粒是否全部透明或有透明与不透明的性状分离进行筛选，在自然群体中鉴定到不同程度的表型修饰，其中182个为全修饰（杂交后全为硬质），35个为部分修饰（杂交后不完全粉质），45个为完全未修饰（杂交后完全为粉质）。这些数据表明，自然群体中有很大比例(30%)的种质由于不完全修饰而不适合进行维生素A生物强化，而Ven1A619是一种可能增加玉米籽粒中β-类胡萝卜素含量的罕见等位基因。利用GWAS分析在1,3,6,8号染色体上鉴定到6个与修饰相关联的峰（图5）。

图5 GWAS分析自然群体中Ven1A619的修饰因子及硬质胚乳形成的模式图。

研究结论

玉米籽粒透明质是一个复杂的表型，本研究为理解透明胚乳如何形成提供了新见解。图5e展示的模型说明了通过类胡萝卜素作用于淀粉体膜干扰籽粒透明表型的可能机制。在含有少量非极性类胡萝卜素的白玉米品种或品系中，当胚乳进入蜡熟期时，在SGs和PBs的协同作用下，淀粉膜发生降解，为透明状胚乳的形成奠定了基础。这些相互作用可被淀粉体膜中非极性类胡萝卜素的增加所破坏，这些非极性类胡萝卜素在胚乳干燥过程中通过改变膜的物理性质来稳定膜；这些生化变化削弱PBs和细胞质内容物在SGs上的凝结，导致不透明胚乳表型的形成；这种表型可能阻碍提高β-类胡萝卜素含量的优良等位基因的利用。修饰因子可以将Ven1A619 修饰，消除β-类胡萝卜素等非极性胡萝卜素对淀粉体膜以及蛋白体-淀粉体致密排布的影响，而形成硬质胚乳。尽管修饰因子的克隆及其机制仍需要进一步研究，但它们在自然群体中的存在拓宽了培育高含量类胡萝卜素玉米品种的种质资源，这将有助于改善缺乏维生素A的儿童的营养。

编者按

欧易生物拥有专业的动植物基因组研发团队，为客户提供基因组重测序、BSA分析、GWAS分析、群体进化分析、Agilent全外显子捕获测序、三代测序、de novo组装、基因注释、比较基因组、个性化分析及多组学联合分析等高质量的技术服务，多名博士级专业人员，经过多年经验沉淀积累，具备多角度分析问题能力，提供多元化项目技术服务，多组学技术平台联合支撑，极力打造一站式服务。

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