1. CircRNA背景及分析流程简介

1.1. 背景简介

环形RNA是一类在真核生物中广泛存在的具有特殊环状结构的非编码RNA分子。已有文献表明，在生物体内，环形RNA有着miRNA海绵、RBP海绵以及翻译短肽等多项功能，在许多生物学过程中发挥着重要作用。目前研究表明，大部分环形RNA来源于蛋白编码基因的外显子区域。在pre-mRNA剪接的过程中，除典型的内含子剪接事件外，还可能会发生5’端到3’端的反向剪接事件，从而形成环形RNA。因此，剪接产物中环形RNA所占比例是环形RNA分析的重要指标之一，具有高成环比例的环形RNA分子，可能具有更加重要的生物学功能。同时，同一基因内部也可能产生多种不同的环形RNA，基因内对环形RNA产生位点的使用偏好，也在一定程度上反映了转录过程对环形RNA产生的调控。因此，环形RNA转录本水平的准确定量，是目前环形RNA分析的重要基础。
为了解决该问题，赵方庆团队开发了一个新的环形RNA分析算法。根据已有工具鉴定出的环形RNA成环位点信息，研究人员重构了具有反向剪接特征的环形RNA参考序列，简化了复杂的反向剪接位点比对问题，并结合测序读段比对到参考基因组和环形序列的结果，筛选出了高置信度的来自环形RNA的读段，解决了目前环形RNA识别和定量方法中准确度低和假阳性率高的问题。作者在模拟数据和真实转录组数据中，对多种常用环形RNA识别软件的表现进行了综合评估，发现该研究中开发的方法在环形RNA表达量和成环比例的计算中，均取得了最佳的结果。

1.2. 分析流程

将下机测序数据进行质控，去除接头及各类低质量序列。随后借助于CIRIquant，使用Hisat2与参考基因组比对，Stringtie进行基因水平定量；同时使用bwa-men与参考基因组比对，进行circRNA的鉴定，构建circRNA参考序列；将构建的circRNA序列作为参考基因组使用Hisat2再次进行比对，筛选出高置信度的来自环形RNA的reads；统计circRNA的表达情况，并注释circRNA信息。通过对circRNA差异分析，筛选出具有显著差异的circRNA所对相应的基因进行后续富集分析。 circRNA信息分析简易流程如下所示。

2. 分析结果

2.1. 测序数据质量控制

对原始测序数据及去除接头后的可用数据进行质量评估。测序数据一般为双端测序，因此，每个测序样本会有两个测序结果。

评估的具体内容：

文件路径	文件说明
`result/01.QC/qc_rawdata/*.html`	RawData-fastqc 文件链接
`result/01.QC/qc_cleandata/*.html`	CleanData-fastqc 文件链接
`result/01.QC/qc_Supplement.html`	Fastqc 格式补充说明

2.2. CIRIquant分析

2.2.1. CIRIquant分析结果文件

1 . 比对结果文件：

结果路径	结果说明
`result/02.CIRIquant/1.mapping/*.flagstat.txt`	各个样本的比对情况统计
`result/02.CIRIquant/1.mapping/*.bw`	与hg38基因组比对的bw结果

以上结果位于文件夹：result/02.CIRIquant/1.mapping/

2 . CIRIquant鉴定结果文件：

结果路径	结果说明
`result/02.CIRIquant/2.circRNA_detection/*.gtf`	CIRIquant鉴定circRNA的gtf文件
`result/02.CIRIquant/2.circRNA_detection/*.bed`	CIRIquant鉴定circRNA的bed文件

以上结果位于文件夹：result/02.CIRIquant/2.circRNA_detection/

3 . CIRIquant鉴定结果的统计结果文件：

结果路径	结果说明
`result/03.circRNA_info/1.circRNA_annotation/*csv`	鉴定的circRNA的注释信息表
`result/03.circRNA_info/2.circRNA_length/*`	鉴定的circRNA的长度分布图
`result/03.circRNA_info/3.circRNA_karyotype/*`	鉴定的circRNA的染色体分布图
`result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/*`	鉴定的circRNA的类型统计图

以上结果位于文件夹：result/03.circRNA_info

以上统计图的可视化文件：result/03.circRNA_info/view.html

表头说明：（result/03.circRNA_info/1.circRNA_annotation/*csv 鉴定的circRNA的注释信息表）

表头	说明
`seqnames`	染色体名称
`start`	circRNA的起始位置
`end`	circRNA的终止位置
`width`	circRNA长度
`strand`	circRNA位于参考序列的正链(+)或负链(-)上
`source`	注释来源，CIRIquant
`type`	注释信息的类型，circRNA
`score`	circRNA的CPM值
`circ_id`	circRNA名称
`circ_type`	circRNA类型，如exon / intron / intergenic / antisense
`bsj`	反向拼接位点 (back-spliced junction) 的reads数量
`fsj`	可变剪切位点 (forward-spliced junction) 的reads数量
`junc_ratio`	环状NA与线性RNA的比值，计算方法为 2 * bsj / ( 2 * bsj + fsj)
`gene_id`	host gene的ensemble id。'NA' 表示没有host gene，说明该circRNA的类型为 'intergenic'
`gene_name`	host gene的HGNC symbol。'NA'同上
`gene_type`	host gene的类型。'NA'同上

2.2.2. 参考基因组比对

测序片段（fragments）是随机打断的，为了确定这些一段由哪些基因转录来，需要将质控后的clean reads比对到参考基因组上。使用HISAT2软件将Clean Reads与参考基因组进行快速精确的比对，获取Reads在参考基因组上的定位信息^[4]。HISAT2软件官方手册。

如果参考基因组组装的较为完善，而且所测物种与参考基因组一致，且相关实验不存在污染，那么实验所产生的测序reads成功比对到基因组的比例会高于70% (Total Mapped Reads or Fragments)。本项目所用参考基因组为 hg38。

2.2.3. circRNA 预测及鉴定

使用CIRIquant鉴定 circRNA ，并预测 circRNA 的表达。目前发现的circRNAs主要来源于基因外显子exon，但还有其他类型，比如来源于内含子intron、基因间intergenic、反义链antisense。为了更进一步了解鉴定得到的circRNA详细信息，随后进行circRNA类型，circRNA 的长度分布，circRNA 的染色体分布分别进行分析，统计分析图如下。

result/03.circRNA_info/2.circRNA_length/Demo-input.png	result/03.circRNA_info/2.circRNA_length/Demo-target.png
result/03.circRNA_info/3.circRNA_karyotype/Demo-input.png	result/03.circRNA_info/3.circRNA_karyotype/Demo-target.png
result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-input_barplot.png	result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-target_barplot.png
result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-input_pie.png	result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-target_pie.png

2.3. circRNA 差异分析

对于无重复样本，使用CIRIquant的CIRI_DE工具鉴定差异表达的circRNA。输出的 DE_score 综合了倍数变化和p值，从而提供了一种有效的方法来对差异表达的circRNA排名。此处我们筛选 |DE_score| > 1 作为显著差异表达结果。

2.3.1. 差异分析结果文件

文件路径	说明
`result/04.DE/targetVSinput_deg_ALL.xls`	circRNA差异分析结果（所有结果）
`result/04.DE/targetVSinput_deg_all-diff.xls`	circRNA差异分析结果（筛选 `\|DE_score\| > 1`后）
`result/04.DE/targetVSinput_deg_all-diff.bed`	circRNA差异分析结果的bed文件（筛选 `\|DE_score\| > 1`后）
`result/04.DE/targetVSinput_deg_up.xls`	仅上调circRNA差异分析结果（筛选 `DE_score > 1`后）
`result/04.DE/targetVSinput_deg_down.xls`	仅下调circRNA差异分析结果（筛选 `DE_score < -1`后）
`result/04.DE/diff-gene-types_count.txt`	所有差异circRNA的host gene的类型统计

以上结果位于文件夹：result/04.DE/

表头说明：（result/04.DE/targetVSinput_deg*.xls差异分析结果文件）

表头	说明
`circRNA_ID`	circRNA名称
`Case_BSJ`	Case组反向拼接位点 (back-spliced junction) 的reads数量
`Case_FSJ`	Case组可变剪切位点 (forward-spliced junction) 的reads数量
`Case_Ratio`	Case组环状NA与线性RNA的比值，计算方法为 2 * bsj / ( 2 * bsj + fsj)
`Ctrl_BSJ`	Ctrl组反向拼接位点 (back-spliced junction) 的reads数量
`Ctrl_FSJ`	Ctrl组可变剪切位点 (forward-spliced junction) 的reads数量
`Ctrl_Ratio`	Ctrl组环状NA与线性RNA的比值，计算方法为 2 * bsj / ( 2 * bsj + fsj)
`DE_score`	差异表达分数（differential expression score）
`DS_score`	差异剪切分数（differential splicing score）
`change`	标注信息，'UP'表示显著上调，'DOWN'表示显著下调，'NOT'为表达没有显著变化。
`circ_type`	同上。circRNA类型，如exon / intron / intergenic / antisense
`gene_id`	同上。host gene的ensemble id。'NA' 表示没有host gene，说明该circRNA的类型为 'intergenic'
`gene_name`	同上。host gene的HGNC symbol。'NA'同上
`gene_type`	同上。host gene的类型。'NA'同上

2.3.2. 差异circRNA的基因组可视化

可将比对结果bw文件、CIRIquant鉴定得到的circRNA的bed文件、以及差异circRNA分析结果同时放入IGV查看，如：

2.4. 差异circRNA宿主基因富集分析

我们将差异circRNA的宿主基因，挑选出仅为 protein coding 的基因，用这些基因进行后续富集分析。

我们根据基因表达量分析得到差异基因之后，必须进一步落到基因的功能上来。对于差异分析而言，往往涉及到成千上万个基因，这会使分析变得很复杂。解决思路是将一个基因列表分成多个部分，从而减少分析的复杂度。为了解决怎么分成不同类，通常会对基因功能进行富集分析, 期望发现在生物学过程中起关键作用的生物通路, 从而揭示和理解生物学过程的基本分子机制。功能富集分析可以将成百上千个基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以减少分析的复杂度。另外，在两种不同实验条件下，激活的通路显然比简单的基因或蛋白列表更有说服力。基因功能富集分析首先要构建基因集（ gene set，如 GO 和 KEGG 数据库等），也就是基因组注释信息进行分类。然后再把我们的目标基因集（差异基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意区分注释与富集。

我们采用 clusterProfiler 软件对差异基因集进行 GO 功能富集分析， KEGG 通路富集分析等。富集分析基于超几何分布原理，其中差异基因集为差异显著分析所得差异基因并注释到 GO 或 KEGG 数据库的基因集，背景基因集为所有进行差异显著分析的基因并注释到 GO 或 KEGG 数据库的基因集。富集分析结果是对每个差异比较组合的所有差异基因集、上调差异基因集、下调差异基因集进行富集。本报告中展示的表格是选取某一个比较组合的富集分析结果，图片是部分富集分析结果。

图 5 基因富集分析原理图

2.4.1. 富集分析结果文件

结果路径	结果说明
GO富集分析结果
`result/05.Enrichment/*/gene.ego_all-p.adjust1.00.csv`	GO富集结果列表（所有结果）
`result/05.Enrichment/*/gene.ego_all-p.adjust0.05.csv`	GO富集结果列表（按p.adj<0.05筛选后）
`result/05.Enrichment/*/gene.ego_ALL.csv`	GO富集结果列表（MF、BP、CC所有结果）
`result/05.Enrichment//gene.GO--barplot.p*`	GO富集分析柱状图
`result/05.Enrichment//gene.GO--dotplot.p*`	GO富集分析散点图
`result/05.Enrichment//gene.GO--DAG.p*`	GO富集分析DAG图
KEGG富集分析结果
`result/05.Enrichment/*/gene.KEGG.csv`	KEGG富集结果列表（所有）
`result/05.Enrichment/*/gene.KEGG_significant.csv`	KEGG富集结果列表（按p.adj<0.05筛选后）
`result/05.Enrichment//gene.KEGG--barplot.p*`	KEGG富集分析柱状图
`result/05.Enrichment//gene.KEGG--dotplot.p*`	KEGG富集分析散点图

以上结果位于文件夹：result/05.Enrichment/

网页预览图：

表头说明：（result/05.Enrichment/*/gene.ego_*.csv GO富集结果列表）

ID	对应GO数据库中的ID
ONTOLOGY	分子功能（Molecular Function），生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）
Description	GO的描述
GeneRatio	对应GO 差异基因数 / 能够对应到GO数据库中同类型的差异基因数
BgRatio	对应GO包含对应物种的基因数 / GO数据库中包含对应物种的基因数
pvalue	富集分析得到的p-value
p.adjust	校正后的p-value
qvalue	富集分析得到的qvalue
geneID	富集基因列表
Count	富集基因数目

表头说明：（result/05.Enrichment/*/gene.KEGG*.csv KEGG富集结果列表）

ID	对应PATHWAY数据库中的ID
Description	PATHWAY的描述
GeneRatio	对应PATHWAY 差异基因数 / 能够对应到PATHWAY数据库中的差异基因数
BgRatio	对应PATHWAY包含对应物种的基因数 / PATHWAY数据库中包含对应物种的基因数
pvalue	富集分析得到的p-value
p.adjust	校正后的p-value
qvalue	富集分析得到的qvalue
geneID	富集基因列表
Count	富集基因数目

2.4.2. GO功能富集分析

GO(Gene Ontology) 是描述基因功能的综合性数据库，可分为生物过程（ biological process ）和细胞组成（ cellular component ）分子功能（ Molecular Function ）三个部分。 GO 功能富集以 padj 小于 0.05 作为为显著性富集的阈值，富集结果见结果文件。

从 GO 富集分析结果中，选取最显著的 30 个 Term 绘制柱状图进行展示，若不足 30 个，则绘制所有 Term ，按生物过程、细胞组分和分子功能三大类别及差异基因上下调分类画的柱状图。

有向无环图 (Directed Acyclic Graph，DAG) 为差异基因 GO 富集分析结果的图形化展示方式。图中，分支代表包含关系，从上至下所定义的功能范围越来越小，选取每个差异比较组合的 GO 富集结果最显著性前 5 位的 GO Term 作为有向无环图的主节点，并通过包含关系，将相关联的 GO Term 一起展示，颜色的深浅代表富集程度。我们的项目中分别绘制生物过程、分子功能和细胞组分的 DAG 图。

图 6 GO富集分析柱状图

图中纵坐标为GO Term，横坐标为GO Term富集的显著性水平，数值越高越显著

图 7 GO富集分析散点图

图中横坐标为注释到GO Term上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为GO Term

图 8 GO富集分析DAG图

每个节点代表一个GO术语，方框代表的是富集程度为TOP5的GO，颜色的深浅代表富集程度，颜色越深就表示富集程度越高，每个节点上展示了该TERM的名称及富集分析的padj

2.4.3. KEGG通路富集分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 是整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。 KEGG 通路富集以 padj 小于 0.05 作为显著性富集的阈值，富集结果见结果文件。

从 KEGG 富集结果中，选取最显著的 20 个 KEGG 通路绘制柱状图进行展示，若不足 20 个，则绘制所有通路，如下图所示。图中横坐标为通路富集的显著性水平，数值越高越显著，纵坐标为 KEGG 通路。

从 KEGG 富集结果中，选取最显著的 20个KEGG 通路绘制散点图进行展示，若不足 20 个，则绘制所有通路，如下图所示。图中横坐标为注释到 KEGG 通路上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为 KEGG 通路，点的大小代表注释到 KEGG 通路上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小。