micRNA建库与分析流程 - 卖萌控的博客

建库测序流程

MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为20-24个核苷酸长度的具有调控功能的非编码RNA，miRNA 是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。

从RNA样品到最终分析结果数据，需要经过样品检测、建库、测序和信息分析等过程，其中测序过程我们采用高通量测序illumina HiSeq/MiSeq测序平台；illumina测序得到的原始图像数据文件经碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。

样品质量检测：利用NanoDrop 2000分光光度计对RNA样品进行初步定量，Aglient 2100对样品浓度精确定量。RNA样品总量、浓度、完整性（RIN值，RNA Integrity Number）、纯度（OD260/OD280比值）符合收样立项标准后，进入下一步的文库构建。

文库构建：Total RNA PEG (polyethylene glycol)沉淀，连接3’接头，PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 胶分离回收，连接5’接头，反转录，PCR扩增，文库切胶回收。

文库质检：Q-PCR方法对文库进行精确定量，文库有效浓度>2nM即可上机测序。

上机测序：将各文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后，进行SE75测序。

图1: Small RNA 文库构建 Workflow

Small RNA测序的接头信息：

RNA 5‘Adapter (RA5), part:

5’-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3’

RNA 3’Adapter (RA3), part:

5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCT-3’ (1ug流程)

5’-CTGTAGGCACCATCAATCAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3’ (10ug流程)

信息分析流程

Raw Data通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度分布等过程完成初级分析；将初级分析得到的clean reads与ncRNA库比对，分类注释ncRNA，并去除reads中的rNRA、tRNA、snRNA、snoRNA等；然后再将reads比对到参考基因组、miRBase上，计算miRNA表达量，注释已知miRNA、预测新的miRNA；然后进行差异miRNA、靶基因预测、功能注释等后续分析。

miRNA生物信息分析流程图