1. 建库测序流程

1.1. Total RNA 样品制备和检测

(1)使用 NanoDrop 2000 分光光度计对 RNA 样品进行初步定量；

(2)使用 Aglient 2100 对 RNA 样品浓度精确定量。 RNA 总量、浓度、完整性（RIN 值，RNA Integrity Number）、纯度（OD260/OD280 比值）符合收样立项标准后，进入下一步的文库构建。

1.2. 文库构建和上机测序

1.2.1. 链特异性文库

文库构建：首先用试剂盒去除 rRNA，将 RNA 打断成短片段。以 RNA 为模板，用六碱基随机引物合成 first strand cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs（dUTP、dATP、dGTP 和 dCTP）和酶合成 second strand cDNA，然后纯化双链 cDNA。纯化的双链 cDNA 先进行末端修复并连接测序接头，然后进行片段大小选择。之后降解含有 U 碱基的 cDNA 第二链，最后进行 PCR 富集，纯化 PCR 产物，得到最终的链特异性文库。

图 2

图 1.2.1 链特异性文库构建 Workflow

1.2.2. 上机测序

文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，随后使用 Agilent 2100 对文库的 insert size 进行检测，insert size 符合预期后，使用 qPCR 方法对文库的有效浓度（>2 nM）进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，进行 PE125 或 PE150 测序。