首页 > 组学教程 > lncRNA建库与分析流程
2022
11-20

lncRNA建库与分析流程

1. 建库测序流程


1.1. Total RNA 样品制备和检测

(1)使用 NanoDrop 2000 分光光度计对 RNA 样品进行初步定量;

(2)使用 Aglient 2100 对 RNA 样品浓度精确定量。 RNA 总量、浓度、完整性 (RIN 值,RNA Integrity Number)、纯度(OD260/OD280 比 值)符合收样立项标准后,进入下一步的文库构建。

1.2. 文库构建和上机测序

1.2.1. 链特异性文库

文库构建: 首先用试剂盒去除 rRNA, 将 RNA 打断成短片段。以 RNA 为模板,用 六碱基随机引物合成 first strand cDNA, 然后加入缓冲液、dNTPs(dUTP、dATP、dGTP 和 dCTP)和酶合成 second strand cDNA, 然后纯化双链 cDNA。纯化的双链 cDNA 先进行末 端修复并连接测序接头,然后进行片段大小选择。之后降解含有 U 碱基 的 cDNA 第二链, 最后进行 PCR 富集, 纯化 PCR 产物,得到最终的链特异性文库。



图 2


图 1.2.1 链特异性文库构建 Workflow



1.2.2. 上机测序

文库构建完成后,先使用 Qubit 2.0 进行初步定量,随后使用 Agilent 2100 对文库的 insert size 进行检测,insert size 符合预期后,使用 qPCR 方法对文库的有效浓度(>2 nM)进行 准确定量,以保证文库质量。库检合格后,进行 PE125 或 PE150 测序。

2. 分析流程



最后编辑:
作者:萌小白
一个热爱网络的青年!

发布评论

表情