读一文掌握LncRNA研究套路

by 星之翼

近年来lncRNA的研究进展迅猛，各类 lncRNA 被大量发现，lncRNA的研究将是 RNA 基因组研究领域非常热门的一个方向。小编也正好也在做lncRNA相关的课题，今天就总结一下lncRNA的研究套路和最新研究进展。

1. LncRNA基本介绍

LncRNA：long non-coding RNAs是一类长度大于200nt，但不编码蛋白质的RNAs，广泛存在于动植物中。它们曾长期被误认为是遗传暗物质，但近些年研究证实这类RNAs在生物的生命活动过程中起着重要的调控作用。

特点

长度在200-100,000nt

没有编码蛋白质潜能

具有细胞或组织类型特异性

表达量和保守性比mRNA低

部分lncRNA不含有polyA尾巴

部分也会翻译小肽段

2. LncRNA功能及作用形式

功能：

结合转录因子，干扰其靶基因，从而调控转录

作为分子海绵，吸附miRNA

与调节蛋白结合，影响蛋白多聚物的形成

招募染色质修饰因子，改变染色质的修饰水平

与mRNA配对结合，影响翻译，剪切，mRNA的稳定性(类似miRNA功能)

作用：

Co-location，也称cis作用

Co-expression, 也称trans作用

3. LncRNA研究基本技术

芯片或测序寻找新的lncRNA

生物信息学分析

lncRNA定位

过表达或敲减功能验证

互作机制研究

4. LncRNA的生物信息学分析

1.基本处理：

rRNA比例评估

基本比对统计，链特异数据评估

Cufflink,stringtie转录本组装

2.特性分析：

序列，位点保守性分析

外显子个数,表达和长度分析

定量差异分析

3.新LncRNA鉴定：

与已知lncRNA库比对过滤

过滤exon<2,长度<200bp,FPKM<1转录本

CPC,CNCI,phyloCSF编码潜能预测

ORF长度过滤

miRNA前体序列过滤

4.功能分析：

顺和反式靶基因预测

靶基因功能富集分析

共表达网络分析

5. LncRNA表达验证

1. qRT-PCR验证:

cDNA质量一定要高，保证没有基因组DNA的污染

按变化倍数排序，优先选择差异变化明显的lncRNA

按FPKM或reads count排序，优先选择表达量高的lncRNA

2. Northern Blot：

既可以验证lncRNA的表达丰度又可以验证序列信息，但精度不如qRT-PCR

3. cDNA末端快速扩增(RACE)

确定lncRNA 5’和3’末端序列，进而获得lncRNA的全长信息

6. LncRNA定位验证

1.FISH(Fluorescence in Situ Hybridization)验证其亚细胞定位，因为其亚细胞定位与lncRNA的调控机制和功能相关。

2.对于已知lncRNA可以通过RNALocate数据库检索其亚细胞定位。

7. LncRNA功能验证

1.功能获得：

过表达载体，观察过表达lncRNA后对细胞增殖、凋亡、侵袭等影响。

2.功能缺失：

的干扰效率却很低。因为RNA干扰作用只作用在胞浆内，细胞核中的lncRNA无法起作用，这时一般的siRNA或者shRNA方法可能不适用。

3.其他敲减方法：CRISPR/Cas9、反义寡核苷酸、位点反转和启动子缺失等方法。

8. 非编码能力验证

构建含有肽段和lncRNA的质粒，验证其是否有编码能力。

9. LncRNA互作验证

1.RIP（蛋白已知，RNA未知）

RIP（RNA immunoprecipitation）又称为RNA结合蛋白免疫沉淀技术，相当于RNA的ChIP实验（染色质免疫沉淀）。

目的：RIP是研究RNA与蛋白相互作用的重要手段，利用RIP可以证明蛋白是否与lncRNA发生相互作用。

原理：利用目的蛋白结合RNA形成沉淀复合物，从沉淀的RNA蛋白复合物中纯化RNA，再进行定量或测序检测。

2.RNA-pull down （RNA已知，蛋白未知）

目的：RNA pull-down实验主要用来寻找与目的lncRNA结合的蛋白。

原理：蛋白与生物素标记的RNA孵育结合，富集的蛋白通过SDS-PAGE分离，最后选择特异性蛋白条带进行质谱鉴定。

3. EMSA(RNA已知，蛋白已知)

目的：RNA EMSA是通过凝胶电泳迁移检测蛋白-RNA互作的一种技术。

原理：标记的RNA探针和蛋白孵育，当蛋白-RNA复合体形成后，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，来确定RNA结合蛋白的特异性。

10. LncRNA研究最新案例和进展

1.案例-肿瘤

期刊：Nat Cell Biol(IF=20.06)

Grelet et al. A regulated PNUTSmRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumour.

Nat Cell Biol. 2017 Sep;19(9):1105-1115.

LncRNA对肿瘤进展的贡献以及驱动其表达的调控机制是热点研究领域。PNUTS基因的pre-RNA在不同条件下能剪切成两种产物：lncRNA-PNUTS和正常mRNA-PNUTS,两种分子在肿瘤中发挥着不同作用，此研究详细的揭示其产生的剪切机制及两种分子的功能机制。

点评：实验机制王道文章

2.案例-CRISPR-Cas9

期刊：Nature (IF=40.137)

哺乳动物基因组包含数万个长链非编码RNA的基因座，其中一些已被发现在生命过程中发挥重要作用。但确定这些lncRNA的功能和机制仍具有挑战性。作者开发了基于全基因组规模的CRISPR-Cas9激活筛选系统，可以靶向超过10,000个lncRNA转录起始位点，用于识别影响感兴趣表型的lncRNA 。通过此技术发现有11个lncRNAs在募集活化因子后介导人类黑素瘤细胞BRAF抑制剂的抗性。

点评：从组学高通量筛选到功能高通量筛选的标杆文章

3.案例-单细胞核测序

期刊：Nat Commun (IF=12.124)