测序数据上传NCBI怎么又报错了？

高通量测序时代，大量的原始测序数据都流向了NCBI的SRA数据库。尽心尽责的将文章有关的测序数据上传至公共平台发布，一方面，是对生物领域科学研究的奉献，方便数据再利用，进行新探索；另一方面，可进行数据分析重现、验证等，为课题研究的真实性提供依据。

但是，很多操作过数据上传的小伙伴们都发现，认真做好这件事可真不容易，成功拿到传说中的SRA accession number（序列检索号码）仿佛经历了九九八十一难。从申请开始，就会有各种莫名的“error”、“warning”从天而降，好不容易走到最后一步，可能数据上传又出错了，或者怎么也传不上去……

今天我汇总自己的上传经历以及被频繁咨询的各种上传问题，给大家分享整理汇总好的一套操作指南，内含丰富的友情提示，防报错防警告你值得拥有！

SRA数据库简介

数据库地址：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra

SRA（Sequence Read Archieve）数据库是由美国国家生物技术信息中心 (National Center of Biotechnology Information)搭建的存放原始测序数据的地方。SRA兼容不同测序平台的数据，比如Sanger测序、Illumina测序等，所以无论是转录组、微生物扩增子，还是宏基因组等组学分析，都可以将原始测序数据上传SRA。SRA是使用率最为广泛的数据上传平台。此外，SRA与EBI（European Bioinformatics Institute）、GEO（Gene Expression Omnibus）等其他数据库都存在数据关联共享。所以SRA是大部分科研小伙伴分享测序数据的首选。

文献使用示例

数据上传完成后会得到非常多的ID。我们挑选可用的ID后，一般在文献的材料方法部分指明将原始测序数据（raw sequence data）上传在了NCBI的SRA数据库（图1）。那么有需要的小伙伴就可以在SRA库中搜索ID，精准查到相关数据。

图1 文献描述示例

数据上传

Tips 数据上传会遇到一些问题，如果自己解决不了，可以直接跟SRA后台发邮件沟通，他们的处理效率非常高而且非常耐心，一般2天左右就会回复邮件。

针对SRA上传相关问题的联系邮箱：[email protected]

数据上传地址：https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/

在SRA平台注册账号登录后，即可创建上传任务。总体有8个步骤（图2）。主要包含相关信息填写（1至6步）和测序数据上传（0或7步）。

Tips账号注册申请后需要进注册时填写的邮箱验证通过，否则只能登录，界面没有“New submission”的选项。

图2 数据上传步骤总览

1.Submitter

登录后，界面中有“New submission”的选项（图3），点击即可创建上传任务。

Tips未完成的上传任务，SRA会保存已填写的结果，所以支持不连续填写。下次填写，可在界面底部的任务记录，直接点击任务编号，进入未完成的任务。

图3 New submission界面

点击创建任务后，即进入上传者信息（submitter）界面（图4），此时会获得一个以SUB开头的编号，用于记录上传进程。在该界面填写完上传人姓名、邮箱信息，点击“continue”。

Tips 星号“ * ”为必填项，其他可不填。由于 qq.com，163.com， foxmail.com 可能拒收NCBI邮件，为确保接收需填写这三类邮箱以外的备用（secondary）邮箱，如学校、单位邮箱等，否则点击“continue”后界面无法跳转。

图4 Submitter界面

2.问卷（General）

跳转至General界面（图5），调查3个问题：

1）是否创建过Bioproject（研究课题描述）；

2）是否创建过Biosample（样本信息描述，如样本类型、采样点信息等）；

3）选择数据发布时间。

因为有些大型项目，可能多年采集样本分批测序，所以会共用一个Bioproject；或者同一份样本同时进行了16S和ITS测序，则可以共用一个Biosample。所以NCBI支持调用以前的信息，避免重复填写。

在该界面根据自己数据的情况，若已有Bioproject和Biosample，则勾选“Yes”，并填写PRJNA开头的Bioproject编号，方便SRA进行匹配；若没有，则勾选“No”。

图5-1 Genera-Bioproject界面

图5-2 Genera-Biosample界面

然后是数据发布时间选择（图5-3）。数据状态分上传和发布两种，完成上传后，表示数据已存放至SRA平台，但是其他人通过关键词搜索等无法查到这部分数据；完成发布，即Release，则其他人检索可以查到该数据。由于一般情况都是先上传数据，但文章还没正式发表，所以不想立即公开测序数据。

SRA提供了2个选择：

1）上传完成后立即发布；

2）自定义发布时间，默认只能选择一年以内的时间范围，即最晚也需要在一年后释放。

推荐自定义。其他信息选填，可结合项目信息继续完善。完成后点击“continue”。

Tips如果需要更改发布时间或者临时查看，比如遇到数据还未发布但审稿人需要查看，有两种处理方式：1）在登录界面的“Manage data”栏目点击“create reviewer link”生成一个数据浏览的链接，即检索不到但可以进入链接查看；2）给SRA后台发邮件请求更改发布时间。

图5-3 Genera-Release data界面

3.Project info

跳转至Project info界面（图6），填写数据对应的研究课题，项目标题、内容简介等，方便查询数据的人了解相关背景。内容简介不限定字数，详略都可，也可引用文章摘要。

图6 Project info界面

4.Biosample type

跳转至样本类型选择（图7-1），根据上传数据的样本特征勾选。SRA提供了10种样本类型，比如RNA-seq可能对应“Microbe”（单菌株）、“Model organism or animal”（经典的模式物种）、“Human”（人）、“Plant”（植物）。

图7-1 Biosample type界面

对于微生物群落的扩增子、宏基因组等测序分析，可能对应“Genome, metagenome or marker sequences (MIxS compliant)”（基因组序列分析）或者“Metagenome or environmental”（宏样本或环境样本）。

具体的，“Genome, metagenome or marker sequences (MIxS compliant)”包含9种类型（图7-2），一般对应“Environmental/Metagenome Genomic Sequences (MIMS)”，勾选后又有15种类型（图7-3），比如空气、宿主相关的、沉积物、土壤、废水、自然环境水体等，可根据样本特征勾选。如果以上15种都不符合，比如青贮发酵样本，则选择“Metagenome or environmental sample”。

下一步，针对选择的样本类型，会有对应的样本属性表格，所以如果样本类型不合适，会影响后续属性填写。

Tips每种样本属性表格都有必填列，如果属性类别不符合样本特征，比如你本来是环境样本，遇到有宿主信息必填，说明样本类型不合适，可回到该步骤重新选择。

图7-2 基因组分析样本类型

图7-3群落分析样本类型

5.Attributes

跳转至“Attributes”样本属性填写的界面（图8-1）。支持网页端填写和Excel模板导出本地填写。样本少可以网页输入；样本很多，以防断网中断等，建议导出模板。

图8-1 Biosample attribute 界面

以“Metagenome or environmental sample”类型的本地excel为例（图8-2，8-3），绿色为必填列，蓝色为至少填其中一列，黄色为选填列。一个样本一行，需要按照表头的帮助文档规范填写，如采样点填写，国家的城市，必须以冒号分隔（图8-2）。黄色列多与实验设计相关，可以尽量准确描述。表格末尾可以自定义输入表头，添加列信息。填写完成后上传该文档，跳转至下一步。

Tips不一定所有实验都采集了经纬度信息，如果没有可填写“not collected”，且不可以是其他字符，否则SRA不识别，无法下一步。

图8-2 样本属性表格（一）

Tips除了样本名/标题，行与行之间的描述信息（其他列）不能完全一样，否则会报错，无法跳转下一步。如，某两行可以有5列填写完全一样，但有1列填写不一样。一般分组之间，可能因为采样点不同或者实验处理条件不同，所以不会重复。但是同一个分组内的生物学重复样本，所有列都一样，这是最频繁的报错之一。解决方法，如图8-3，在末尾添加一列“replicate”，对组内的重复样本标记序号，即可避免组内样本描述重复。

图8-3 样本属性表格（二）

6.Metadata

如图9-1，用于SRA后台匹配样本属性描述和样本测序信息。

图9-1 Metadata界面

以导出模板的本地填写为例。除第一列以外，蓝色为必填列，其余为选填。16S等扩增子测序，则“Library_strategy”选择“AMPLICON”，“library source”选择“METAGENOMIC”，“library selection”选择“PCR”。若为宏基因组测序，则依次选 “WGS”、“METAGENOMIC”、“RANDOM”。其他列则根据测序平台对应选择（图9-2）。