项目文章丨单细胞转录组测序揭示肾癌和癌栓肿瘤微环境差异

近日，北京博奥晶典生物技术有限公司合作中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）慈维敏教授团队和北京大学第三医院泌尿外科马潞林教授、刘承教授团队在 Genome Biology（IF: 13.583）发表了应用单细胞转录组测序揭示肾癌和癌栓肿瘤微环境差异的研究成果。本研究中10x 单细胞转录组测序由北京博奥晶典生物技术有限公司提供。

【发表期刊】Genome Biology

【影响因子】13.583

【发表时间】2022年3月31日

【发表单位】中国科学院北京基因组研究所 & 北京大学第三医院

研究背景

在晚期肾细胞癌 (RCC) 中经常发生伴有肿瘤血栓的血管侵犯。血栓切除术是最具挑战性的手术之一，具有较高的围手术期发病率和死亡率。然而，人们对驱动肿瘤血栓形成的机制知之甚少。因此亟需提高对肾癌和癌栓的深入认识，解析癌栓发生发展机制，为患者提供更加有效的新辅助治疗方案。

研究思路

主要结果

1. 肾脏原发性肿瘤和肿瘤血栓微环境的 scRNA-seq 分析

为了阐明静脉肿瘤血栓中的肿瘤生态系统，研究人员从 8 例未接受治疗的 ccRCC 患者集了 19 份手术组织标本（发现队列）用于 scRNA-seq。分别是肿瘤血栓（TT, n=8）、配对的原发性肿瘤（PT, n=8）和邻近肾组织（ART, n=3）。过滤后共获得约 12 万个细胞定义为 9 种主要细胞类型：上皮细胞、 T 细胞、NK 细胞、骨髓细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞 (EC)、B 细胞、浆细胞和肥大细胞。这些细胞类型在所有 8 例病人的 16 份PT 和 TT 样本之间都存在，尽管细胞占比不同，但没有规律性的变化（图 1g）。

图1 肾脏原发性肿瘤和肿瘤血栓微环境的 scRNA-seq 分析

2. 原发性肿瘤和肿瘤血栓中 T/NK 细胞的异质性分析

鉴于最近的研究发现免疫检查点阻断 (ICB) 治疗后 ccRCC 患者的肿瘤血栓显著减少，因此研究人员推测肿瘤浸润性免疫细胞可能在此过程中发挥重要作用。因此，首先对 T 和 NK 细胞进行了无监督聚类，并在 ART、PT 和 TT 中获得了 12 个subcluster（图 2a-d)。分析比较 ART、PT 和 TT 中每个簇的百分比（图 2e），表明 PT 可能处于更免疫抑制状态。有证据表明，某些处于祖细胞衰竭状态的 CD8+ T 细胞可以增强 ICB 治疗在黑色素瘤和肾癌中的疗效。同时部分 ccRCC 患者使用 ICB 治疗后 TT 会显著消退，因此猜测一些 revover 的 CD8+ T 细胞亚群可能类似于祖细胞耗竭的表型。果然，CD8-C1 子簇具有显著富集的祖细胞耗竭特征，相对于 PT，这些耗竭特征的基因在 TT 样本中表达显著上调（图 2g），这些发现后续在独立验证队列数据中得到了再现（图 2h）。

图2 TT，PT 和 ART 中 T/NK 细胞的异质性分析

3. 巨噬细胞在肿瘤血栓中表现出增强的 ECM 重塑活性，在原发性肿瘤中表现出免疫反应性扰动

先天免疫细胞可能是血管内 TT 快速扩展的第一道屏障，这可能对肿瘤血栓形成和对 ICB 治疗的抵抗有重要影响。因此，对所有 19 份样本中的 16,267 个髓系细胞进行二次分群。髓系细胞表现出显著的异质性，分为 14 个簇（图 3a-c）。除中性粒细胞外，几乎所有免疫检查点和逃避相关的基因都在髓系亚群中高度表达（图 3e）。这些结果表明，中性粒细胞可能更有效地对抗癌细胞，而其他巨噬细胞、单核细胞和 DC 可能已经被 PT 或 TT 肿瘤细胞“教育”。

值得注意的是，本结果无法通过已知的标记基因清楚地区分 M1 和 M2 巨噬细胞，但基因表达特征证实它们都是肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。在 PT 组 TAM 中检测到免疫检查点和逃避 marker 基因表达升高（图 3h）。在 TT 组中，观察到与肿瘤进展相关途径相关的特征评分增加，包括上皮间质转化 (EMT)、细胞外结构组织和血管生成（图 3g-h ）。

总的来说，TAM 的复杂性表明 PT 和 TT 之间存在明显的功能障碍状态，PT 中具有更强的免疫抑制表型，并且 TT 中的 ECM 重塑增强。

图3 TT，PT 和 ART 中髓系细胞的详细特征分析

4. 原发性肿瘤和肿瘤血栓中恶性细胞的鉴定和表征

使用肌成纤维细胞和内皮细胞作为参考对 scRNA 数据进行 InferCNV 分析。7 名患者中在 TT 和 PT 之间显示出相似的 CNV 模式和亚克隆结构（图4a），P06 患者独自一种模式（图 4b）。对 15,012 个 PT 恶性上皮细胞和 12,078 个 TT 恶性上皮细胞进行 recluster（图 4c-e），并在整体及4个 subcluster 之间进行了基因表达差异分析，并对差异基因进行 GSEA 和 GSVA （图 4 f-g）。结果发现，与 TT 相比，PT 中免疫检查点和逃避基因的表达上调（图 4g-h) ，这证明了它们促进免疫逃逸和抑制抗肿瘤免疫反应的能力。一致地，在 PT 中观察到显著更高比例的 CD274+ 恶性细胞，在 TT 中观察到更多的 COL4A1+ 肿瘤细胞（图 4i），表明 PT 中较高的免疫抑制状态和 TT 中 ECM 的动态重塑。总之，在单细胞分辨率下发现 PT 中的恶性细胞表现出更强的免疫抑制表型，而 TT 中的肿瘤细胞表现出更高的 ECM 重编程状态。

图4 TT 和 PT 中恶性细胞的鉴定和表征

5. TT，PT 和 ART 中内皮细胞和肌成纤维细胞的详细表征

为了进一步评估可能促进肿瘤血栓在血管内空间中生长和扩展的内皮细胞作用，研究人员对内皮细胞 (ECs) 进行了 recluster，获得 6 个不同的簇（图 5a-c），发现 TT 中 Endo2 的比例高于 ART 和 PT（图 5d ），这表明癌症相关的脉管系统形成可能有助于 TTs 在血管内空间中的快速延伸。同样地，在独立验证集合中也观察到 TT 中 Endo2 子集的百分比显著增加（图 5e），此外，高水平的 Endo2 基因特征与 TCGA KIRC 队列中的低生存率显著相关（图 5f ）。分析还发现 EC 在 TT 中具有增强的 ECM 重塑和细胞增殖活性（图 5g）。

因此，该结果表明，除了 TAM 和 TT 中的癌细胞外，TT 中的内皮细胞可能会修饰 ECM 以促进肿瘤血栓的生长，而针对具有 Endo2 特征的细胞的分子疗法可能能够特异性地降低腔静脉血栓的阶段。

图5 TT，PT 和 ART 中内皮细胞和肌成纤维细胞的详细表征

6. 肿瘤-间质细胞之间互作分析

为了识别可能的非细胞自主效应，研究人员使用 CellPhoneDB 通过已知的受体-配体对识别不同细胞群之间的推定信号传导。与 ART 和 PT 相比，ECM 重塑途径中多个配体-受体对的相互作用在 TT 中更强，并且预测肌成纤维细胞具有与肿瘤细胞和 EC 显着相互作用的最强信号，并在 bulk RNA-seq 独立验证集中验证了这一发现。并且分析进一步明确了肿瘤-间质相互作用与透明肾细胞癌患者生存期降低显著相关。

图6 肿瘤-间质细胞之间互作及其与生存期关联分析

全文结论及研究意义

1、本研究全景式地刻画了肾透明细胞癌原发肿瘤和癌栓的肿瘤微环境差异，揭示了原发性肿瘤和肿瘤血栓之间在肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞等均存在异质性；

2、本研究发现癌栓组织中肿瘤细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞内胞外基质（ECM）重塑相关通路均显著增强；

3、本研究通过细胞和细胞间互作分析，明确了肿瘤-间质相互作用与透明肾细胞癌患者生存期降低显著相关；

4、总之，本研究为晚期肾癌缩减癌栓的新辅助治疗提供了潜在治疗靶点，为靶向细胞外基质（ECM）的治疗提供了理论基础。

参考文献

Shi Y, Zhang Q, Bi H, LuM, Tan Y, Zou D, Ge L, Chen Z, Liu C, Ci W, Ma L. Decoding the multicellular ecosystem of vena caval tumor thrombus in clear cell renal cell carcinoma by single-cell RNA sequencing. Genome Biol. 2022 Mar 31;23(1):87.doi: 10.1186/s13059-022-02651-9. PMID: 35361264; PMCID: PMC 8969307.

转自：博奥晶典单细胞