ATAC-Seq分析教程：用ChIPseeker对peaks进行注释和可视化—科研必备表观遗传学知识

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上一过程用IDR对重复样本peaks的一致性进行了评估，同时得到了merge后的一致性的peaks——sample-idr，接下来就是对peaks的注释。这篇主要介绍用Y叔的R包ChIPseeker对peaks的方位（如peaks方位落在启动子、UTR、内含子等）以及peaks接近基因的注释。

ChIPseeker

ChIPseeker尽管最初是为了ChIP-seq注释而写的一个R包，但它不只局限于ChIP-seq，也可用于ATAC-Seq等其他富集peaks注释，也可用于lincRNA注释、DNA breakpoints的断点方位注释等一切genomic coordination的注释，另外提供了丰厚的可视化功用。

运用办法

运用ChIPseeker需求准备两个文件：一个就是要注释的peaks的文件，需满意BED格式。另一个就是注释参阅文件，即需求一个包括注释信息的TxDb目标。Bioconductor提供了30个TxDb包，假如其中有研讨的物种就能够直接下载装置此物种的TxDb信息。假如研讨的物种没有已知的TxDb，能够运用GenomicFeatures包的函数（makeTxDbFromUCSC，makeTxDbFromBiomart）制造TxDb目标：

makeTxDbFromUCSC：经过UCSC在线制造TxDb
makeTxDbFromBiomart: 经过ensembl在线制造TxDb
makeTxDbFromGRanges：经过GRanges目标制造TxDb
makeTxDbFromGFF：经过解析GFF文件制造TxDb

制造TxDb办法示例：

如用人的参阅基因信息来做注释，从UCSC生成TxDb:

library(GenomicFeatures)
hg19.refseq.db <- makeTxDbFromUCSC(genome=\"hg19\", table=\"refGene\")

用GFF文件做裂殖酵母的注释

download.file(\"ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3\", \"schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3\")require(GenomicFeatures)
spombe <- makeTxDbFromGFF(\"schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3\")

具体过程如下：

第1步：下载装置ChIPseeker注释相关的包

从Bioconductor直接下载，或从github装置最新版本

source (\"https://bioconductor.org/biocLite.R\")
biocLite(\"ChIPseeker\")
# 下载人的基因和lincRNA的TxDb目标
biocLite(\"org.Hs.eg.db\")
biocLite(\"TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene\")
biocLite(\"TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.lincRNAsTranscripts\")
biocLite(\"clusterProfiler\")
#载入各种包
library(\"ChIPseeker\")
library(clusterProfiler)
library(\"org.Hs.eg.db\")
library(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
txdb <- TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene
library(\"TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.lincRNAsTranscripts\")
lincRNA_txdb=TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.lincRNAsTranscripts

第2步：读入peaks文件

函数readPeakFile读入peaks文件

nanog <- readPeakFile(\"./idr_out.bed/nanog_idr-bed\")
pou5f1 <- readPeakFile(\"./idr_out.bed/pou5f1_idr-bed\")

第3步：注释peaks

peaks的注释是用的annotatePeak函数，能够单独对每个peaks文件进行注释，也能够将多个peaks制造成一个list，进行比较剖析和可视化。

# 制造多个样本比较的list
peaks <- list(Nanog=nanog,Pou5f1=pou5f1)
# promotor区间范围能够自己设定
promoter <- getPromoters(TxDb=txdb, upstream=3000, downstream=3000)
tagMatrixList <- lapply(peaks, getTagMatrix, windows=promoter)
#annotatePeak传入annoDb参数,可进行基因ID转换（Entrez，ENSEMBL，SYMBOL，GENENAME）
peakAnnoList <- lapply(peaks, annotatePeak, TxDb=txdb,tssRegion=c(-3000, 3000), verbose=FALSE,addFlankGeneInfo=TRUE, flankDistance=5000,annoDb=\"org.Hs.eg.db\")

annotatePeak传入annoDb参数,即可进行基因ID转换，将Entrez ID转化为ENSEMBL，SYMBOL，GENENAME，peakAnnoList的成果如下：

seqnames start end width strand annotation geneChr geneStart geneEnd geneLength geneStrand geneId transcriptId distanceToTSS ENSEMBL SYMBOL GENENAME flank_txIds flank_geneIds flank_gene_distances
5 chr3 196625522 196625873 352 * Intron (uc003fwz.4/205564, intron 2 of 9) 3 196594727 196661584 66858 1 205564 uc011bty.2 30795 ENSG00000119231 SENP5 SUMO specific peptidase 5 uc003fwz.4;uc011bty.2 205564;205564 0;0

第4步：可视化

提供了多种可视化办法，如plotAnnoBar(),vennpie(),plotAnnoPie(),plotDistToTSS()等，下面展现了两个样本在基因组特征区域的分布以及转录因子在TSS区域的结合。

plotAnnoBar(peakAnnoList)
plotDistToTSS(peakAnnoList,title=\"Distribution of transcription factor-binding loci n relative to TSS\")

第5步：功用富集剖析

提取peakAnnolist中的基因，结合clusterProfiler包对peaks内的附近基因进行富集注释。

# Create a list with genes from each sample
gene = lapply(peakAnnoList, function(i) as.data.frame(i)$geneId)
# Run GO enrichment analysis 
ego <- enrichGO(gene = entrez, 
                    keytype = \"ENTREZID\", 
                    OrgDb = org.Hs.eg.db, 
                    ont = \"BP\", 
                    pAdjustMethod = \"BH\", 
                    qvalueCutoff = 0.05, 
                    readable = TRUE)
# Dotplot visualization
dotplot(ego, showCategory=50)
# Multiple samples KEGG analysis
compKEGG <- compareCluster(geneCluster = gene, 
                         fun = \"enrichKEGG\",
                         organism = \"human\",
                         pvalueCutoff  = 0.05, 
                         pAdjustMethod = \"BH\")
dotplot(compKEGG, showCategory = 20, title = \"KEGG Pathway Enrichment Analysis\")

第6步：保存文件

# Output peakAnnolist file
save(peakAnnoList,file=\"peakAnnolist.rda\")
write.table(as.data.frame(peakAnnoList$Nanog),file=\"Nanog.PeakAnno\",sep=\'t\',quote = F)
# Output results from GO analysis to a table
cluster_summary <- data.frame(ego)
write.csv(cluster_summary, \"results/clusterProfiler_Nanog.csv\")