偶然听说别人做的转录组和你知道的那个mRNA测序不太一样，都是转录组，他们好像讨论的是lncRNA、miRNA、cricRNA，这么多种类的RNA数据，竟然还是测一次就都有的了，怎么办到的？
这其实做的是全转录组测序。全转录组是特定细胞在某一状体下所有转录产物的集合，就包括了上述提到的编码和非编码RNA等。
大家都不是小孩子了，基迪奥知道你也想全都要。在你着急送样马上想有全转录组数据之前，先来了解一下全转录组一些基本内容吧。本次先和大家分享一下全转录组建库测序方式，具体的ceRNA之间的调控关系分析也会在之后的文章中为大家捋一捋。
全转录组测序
基于NGS，使用同一批样本，构建两种文库进行测序，同时获得多种RNA。
两种文库分别指的是去核糖体链特异性文库和small RNA文库。链特异性文库是长片段文库，将RNA打断测序，可得到mRNA、lncRNA和circRNA。Small RNA文库是短片段文库，可得到miRNA、piRNA等。
这种方式是最经济实惠的，节约样本的同时，也提高了研究结果的可靠性。
全转录组测序——链特异性建库
lncRNA测序采用的就是去核糖体链特异性建库，再进行PE150测序，一般用10-15G Clean data进行测序。全转录组的长片段文库也是用的这种方法，除了lncRNA，还能得到mRNA和circRNA。
链特异性建库流程图
建库步骤
1.去核糖体RNA
在提取了物种总的RNA之后，先去核糖体RNA(rRNA)。rRNA在总RNA中占比高，保守性也高，研究意义不大，还会影响鉴定其他类型RNA，所以先用磁珠吸附rRNA去除掉，不同物种还有不同试剂盒区分。
2.片段化处理
mRNA纯化之后的文库构建通常有两种方法，一种是先用oligo（dT）引物反转录mRNA，再进行cDNA的片段化，另外一种则是先将mRNA打断，再结合随机引物进行反转录。前一种方法主要是针对基因的，后一种方法测的reads对转录本3'端具有比较强的偏好性，所以建议采用先对mRNA打断再进行反转录。
3.合成第一链
从RNA逆转录出cDNA的第一条链。
4.合成第二链
在合成第二链的时候，以第一条链为模版，加入dUTP代替dTTP，这样合成出来的第二条链，就有了U碱基，和第一链就能区分开了。然后富集合成好的双链cDNA片段，进行后续步骤。
5.末端修复
如图中所示，cDNA的两条链可能长度不一，需要将DNA末端补平。
6.添加A碱基
补平后，在两个末端添加A碱基，产生粘性末端，便于后续添加接头。
7.添加测序接头
双链cDNA两端接上Y型接头(adapter)，把这些序列固定，让测序仪可以识别这些序列。
8.USER酶消化
USER酶可以识别DNA中的U碱基，并且糖基化，把糖基化的U碱基从核酸链上切掉，核酸链上形成了一个缺碱基的位置，第二链就在这些空位的位置被切断，降解掉了。
9.PCR扩增
剩下的第一条链，连接了不同的测序接头，通过PCR扩增，扩增出来的片段就有方向性了。
10.上机测序
我们为什么不能用转录组普通poly（A）富集建库测序方式获得全转录组数据？
1. 大部分lncRNA没有poly(A)尾，所以不能用poly(A)富集的方法来富集；
2. 普通mRNA测序加的接头无方向性，无法区分测的是正义链，还是反义链。有的lncRNA就来源于基因的反义链（Antisense lncRNA），能与正义链mRNA结合，起到调控作用。所以我们需要链特异性这种能判断方向的建库方式，减少比对错误，lncRNA注释更准确，利于后续分析。
全转录组建库——Small RNA建库
分成两个文库的根本原因是RNA的长度不同，长片段文库打断之后200-500nt，而small RNA长度大概18-30nt，需要采用不同的测序方法。
Small RNA测序采用富集小RNA片段建库方法，Small RNA可以切胶回收，也可以通过试剂盒直接提取small RNA。进行SE50测序，一般用10-20M clean reads进行测序，实现miRNA、siRNA以及piRNA等小RNA鉴定和定量。
建库步骤
RNA提取→连接3’和5’接头→反转录cDNA→PCR扩增→文库纯化→上机测序
Small RNA建库测序流程图
去线性RNA建库
如果想circRNA做更准确的分析，还可以针对circRNA单独建库。全转录组建库的方式变成链特异性建库+去线性RNA建库+Small RNA建库。建库步骤和链特异性建库唯一不同的就是在最开始先消化掉了线性RNA，再去rRNA建库测序。
相比之下，链特异性建库的方式获得的circRNA，高表达的circRNA居多，这种去线性RNA的方式，获得的circRNA更多。
线性RNA消化示意图
各种建库方式可获得的RNA类型总结如下，大家可以根据自己的目的选择相应的方式。
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