Dr. cell专栏 | Loupe Cell Browser操作宝典

还记得我们前两天培训中的Loupe可视化软件的内容吗？今天我们就趁热打铁一起来重温一下。文章很长，建议收藏，反复查看！

10x Genomics拥有从实验到数据分析一套完整的单细胞解决方案，single cell analysis pipelines（Cell Ranger）和可视化的互动分析软件（Loupe Cell Browser）是解决方案中的亮点，10x转录组数据必经Cell Ranger进行质控、参考基因组比对等初步的数据处理，Cell Ranger也可以继续进行基本的单细胞分析包括细胞聚类和差异基因筛选，但现在主流的单细胞分析方法常用R包Seurat。Cell Ranger和Seurat的分析结果都可以在Loupe Cell Browser中进行可视化操作，方便研究者对数据分析结果有更好的了解和挖掘。

那什么是Loupe Cell Browser？

Loupe Cell Browser是一个适用于Windows和MacOS的桌面应用程序，用于打开10X单细胞分析结果文件中的.cloupe文件，以便快捷地查看和分析10x Chromium™ Single Cell 5' 和3' 基因表达数据。目前Loupe Cell Browser已更新至3.3.1版本，可应用于Cell Ranger 1.3、2.x及3.0产生的.cloupe文件和Seurat分析结果。

首先通过下载安装Loupe Cell Browser，界面会出现10x官方与Fred Hutchinson Cancer Research Center合作产生的单细胞转录组数据AMLTutorial.cloupe，点击相应行即可打开；若要打开其他新的cloupe文件点击下方按钮。在我们公司所提供的分析结果中，每一个样本都有相应的.cloupe文件，Loupe Cell Browser安装后可以直接点击sample xx.cloupe文件打开。

打开后我们可以看到多种操作工具，运用这些工具我们可以实现八大应用：

1. Significant Features寻找差异表达基因

2. Identifying Cell Types鉴定细胞类型

3. Exploring Substructure自定义细胞群

4. Identifying Cell Subtypes探索细胞亚型

5. Sharing Results输出想要的图表

6. Integrated Gene Expression and V(D)J Analysis整合分析10x Chromium™ Single Cell 5' 端表达谱和V(D)J数据

7. Feature Barcoding通过细胞表面蛋白识别细胞类型

8. 可以导入其他分析方法的结果（如Seurat），实现以上分析操作

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Finding Significant Genes寻找差异表达基因

以AMLStatus为例，该数据出自zheng等人的研究[1]，通过cellranger aggr对三个样本合并处理，包括AMLNormal1 (1988 cells)、AMLNormal2 (2497 cells)和AMLPatient (3929 cells)。

使用“分屏”工具选择所要展示的数据AMLStatus，则会按Normal和Patient分屏显示，点击“计算”按钮计算Normal和Patient差异表达基因，在Gene/Feature Expression模式下查看基因表达差异。

Zheng et al, Massively parallel digital tranional profiling of single cells. (2017; doi:10.1038/ncomms14049)

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Identifying Cell Types鉴定细胞类型

根据marker基因鉴定细胞类型，在Gene/Feature Expression模式下操作，如查看B细胞marker CD79A和CD79B在细胞群中的表达，发现B细胞marker明显地聚集在一群中表达，亮红或亮绿说明CD79A和CD79B呈高表达（基因表达的色阶有多种选择），高亮的细胞从而被鉴定为B细胞群。

除了直接在搜索框中输入基因symbol查询外，还可导入细胞marker表格（格式见下图），导入之后在Feature List中就可以按某细胞Markers选择查看。

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Exploring Substructure自定义细胞群

Marker基因鉴定完细胞类型之后，需要接着定义细胞群，赋予对应的细胞类型名称。其中有部分弥散的细胞不在主要的细胞群里，需要用“套索”工具将这部分细胞移除。

若在主群中存在数个子群，利用套索工具，选中子群并命名。

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Identifying Cell Subtypes探索细胞亚型

选择“filters”，利用marker基因鉴定细胞亚型，以TCL1A表达与否为例，区分成熟与非成熟B细胞（成熟的B细胞不表达TCL1A），逐步创建过滤规则，最终将B细胞区分为成熟的和非成熟亚型。

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Sharing Results输出想要的结果

进行了这么多分析操作，您肯定想把辛苦分析到的结果保存下来，比如tSNE图、热图、差异表达基因，那么请接招吧：

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Integrated Gene Expression and V(D)J Analysis整合分析10x Chromium™ Single Cell 5' 端表达谱和V(D)J数据

通过10x Genomics平台，利用barcode标签同一个样本可以同时检测转录组表达和V(D)J序列信息，数据分析后分别得到.cloupe文件和.vloupe文件（使用对应的Loupe V(D)J Browser软件打开），这两种数据在Loupe Cell Browser中可以进行整合分析。以官网数据LungTumorGEX.cloupe和LungTumorT.vloupe为例，进行如下整合操作：

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Feature Barcoding在蛋白水平分析单细胞

10x Genomics结合TotalSeq™-B（3'端转录组）或TotalSeq™-C（5'端转录组）Feature Barcoding抗体标签技术，可以同时在单细胞水平检测转录组和蛋白质表达信息，从两个组学层面综合解析单细胞。数据分析完成后会得到细胞表面蛋白的.cloupe文件，以官网数据MALT Gene Expression + Feature Barcoding Antibodies为例，通过蛋白水平识别细胞类型，这与转录组水平的识别结果相辅相成，使得对细胞类型的鉴定更加精确：

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可以导入其他分析方法的结果（如Seurat），实现以上分析操作

单细胞研究如火如荼，单细胞的分析方法也层出不穷，像主流的Seurat分析，但单细胞可视化操作软件却比较少见，Loupe Cell Browser的出现使研究者们可以十分便捷地挖掘自己的单细胞数据。为了能够与不同的分析方法无缝衔接，Loupe Cell Browser增设了相应的功能，通过使用3.1.x版本将Seurat等其他方法产生的降维坐标.csv文件和细胞分群.csv文件导入软件内，就可以进行同cellranger分析结果一样的分析操作：