10分微生物物种分析文章是怎样炼成的

物种分析作为微生物群落研究的核心，决定了文章最终是否能够揭示分组差异的微生物响应/驱动机制。今天，我跟大家分享一篇非常有特色的物种分析案例，文章通过多种高级分析方法，找到了可以指示珊瑚生态系统扰动的微生物。

期刊 2019 Microbiome IF=10.465

研究背景

不论是局部区域还是全球尺度，珊瑚生态系统都面临着前所未有的压力。虽然微生物对珊瑚礁稳定性和功能的重要贡献已被广泛认知，但不同的珊瑚礁微生物群落对环境扰动有何响应、微生物群落是否足够敏感作为预测环境异常的指示等尚不清楚。故研究选定大堡礁海域，通过大量的样本分析，建立一个全面的微生物参考数据库，以鉴定评估微生物群落的诊断价值，从而推进珊瑚礁生态系统微生物监测预警体系的构建。

实验设计

1年的时间尺度内，采集3个海湾区（Geoffrey Bay、Channel bay、Pioneer Bay）的海水（n = 48）、沉积物（n = 48）、2种珊瑚的组织（n = 48、n = 42）和外粘液（n = 46、n = 42）、2种海绵（n = 42、n=30）、1种海草（n = 35）共9种生境类型的381份样本进行16S V1-V3区测序分析。具体采样设计如图1。

图1 实验采样设计

研究思路

如图2，为了找到可以指示珊瑚生态系统环境压力变化的微生物，研究首先针对珊瑚的生态系统，从空间尺度选择了与珊瑚密切关联的9种生境类型（图1），并对样本进行了多种环境因子的检测。考虑到监测系统的通用性，研究对3个自然海湾进行了样本采集。

接下来，一方面从alpha多样性和beta多样性层面挑选最有潜在监测价值的生境类型；另一方面，结合环境因子的特征，探索每种生境下物种与环境因子的关联，进而锁定对环境因子响应最为灵敏的生境类型，以及对生境影响最大的环境因子。

最后，基于挑选的生境类型，结合环境因子特征，鉴定与环境因子变化关联的物种，即环境扰动的指示物种。

通过以上一系列讨论，最终给出了珊瑚生态系统环境扰动监测模型的最佳采样点（生境）和监测对比的参考物种。

图2 研究思路

研究结果

1.挑选目标生境和目标环境因子

1.1 alpha/beta多样性分析

首先，借助beta多样性分析评估所有样本的菌群结构与分组特征的关联。如图3，基于OTU水平Bray-Curtis距离开展了NMDS分析，结果表明，相同生境类型的样本聚集在一起，而不同海湾的样本分散开，并且海水和沉积物这两种生境中，不同海湾的样本聚集更紧凑。Adonis分析进一步证明9种生境、两两生境之间菌群结构确实存在显著差异。

考虑到物种监测的通用性，研究针对样本聚集紧凑的海水和沉积物生境作为候选生境，以降低后续监测时不同地域对监测结果的干扰。

针对海水、沉积物分别进行Bray距离的PCoA分析，以放大样本与海湾类型的关系。结果表明沉积物中海湾间的差异显著，而海水中，不存在海湾的空间差异。暗示相对于沉积物，海水可能更适合作为监测系统。

图3 所有样本的NMDS分析

此外，9种生境中alpha多样性差异较大，其中海水、沉积物、海草的物种丰富程度最高。暗示海水、沉积物中丰富的物种资源可进行指示物种筛选。

图4 9种生境的alpha多样性分析

1.2 环境因子关联分析

另一方面，既然是寻找响应环境变化的指示物种，当然离不开物种与环境的关联分析。在9种生境中，物种对环境变化有何响应呢？

针对每种生境类型，研究都开展了RDA分析和VPA分析。通过RDA（图5）直观展示与生境群落结构密切相关的环境因子（长箭头），以海水为例，结果表明光照、温度、叶绿体都对菌群结构有较大影响。再通过VPA分析精细对比每种环境因子对菌群具体的影响程度（表1），结果表明，环境因子对海水的影响程度最高（占海水物种总变异的56%），其中温度是对大部分生境都有重要影响的环境因子。

环境因子关联分析再次表明，海水中的微生物对环境因子有着极强的关联，非常适宜作为监测系统，与beta分析结果一致。

图5环境因子RDA分析

表1 不同生境物种与环境因子VPA分析

2. 鉴定指示物种

考虑到温度是对珊瑚健康状态最重要的影响因子之一，以及温度对生境微生物的重要影响，研究将基于海水系统，寻找该生境中温度的指示物种。

2.1 物种组成分析

考虑到指示物种作为后续生境检测的普遍应用价值，物种不能是个别样本中偶尔存在的物种（在所有样本中出现的频率），也不能数量过低（丰度），影响监测结果参考价值。故将一个生境中80%以上样本都存在的物种分类为“stable”，即稳定物种，将仅存在于50%以下样本中的物种分类为“transient”，即瞬时物种。将物种丰度按＞1%、1-0.1%、<0.1%分为高、中、低三种丰度等级。

如图6，横轴表示丰度等级，红色表示“stable”，蓝色表示“transient”，纵轴表示红色/蓝色物种的相对比例的开方值。结果表明，海水中存在非常多“stable物种，且丰度普遍较高，暗示海水中有丰富优质的物种资源作为指示物种。

图6 物种组成分析

2.2 indicator value分析

基于以上分析结果，后续指示物种分析将针对海水生境与温度的关联，建立海水微生物对温度响应的监测体系。研究将样本温度划分为高中低三级，使用Indicator value分析，即计算每个物种对每个分组的指示值大小和指示作用的显著性。然后以显著性为阈值，筛选每个温度等级的指示物种，然后展示筛选到的指示物种在样本中的丰度分布（图7）。

图7 Indicator分析

2.3 随机森林分析

使用机器学习算法评估物种作为组间差异物种重要性。如图8，随机森林的输出结果中，mean decrease accuracy越大，表示物种对于分类的重要性越高，即作为分组的指示物种越可靠。最终鉴定了门、科两个水平众多的参考物种。为构建微生物评估体系提供了重要参考价值。

图8 随机森林分析

小结

作为珊瑚生态系统的微生物监测体系，一方面，需要有普遍适用价值，即不受采样空间的影响，可以大规模开展；另一方面，需要对环境变化敏感，以起到指示预警作用。故，研究从样本类型和指示物种两个层面进行了分析。首先围绕珊瑚关联的生境类型，基于alpha、beta、环境因子关联分析筛选了海水生境作为监测系统，然后基于物种分析，筛选该生境用于指示环境变化的物种种类。

除了alpha等常规分析，研究使用了比较稀有的indicator分析和随机森林分析，通过一系列层层推进，为珊瑚系统检测构建了非常有前景的微生物监测体系，研究思路和方法值得借鉴。

参考文献

Glasl B, Bourne DG, Frade PR, Thomas T, Schaffelke B, Webster NS. Microbial indicators of environmental perturbations in coral reef ecosystems. Microbiome. 2019;7(1):94. Published 2019 Jun 21. doi:10.1186/s40168-019-0705-7

转自：基迪奥生物