众所周知，单细胞测序已然是发表高分文章的利器，几乎每天都有不止一篇单细胞文章发表。目前，单细胞技术已经广泛应用于肿瘤，免疫，发育生物学，神经科学，细胞治疗，药物研发及动植物研究中。看着别人的单细胞文章发发发不停，不知您是否也心痒痒？其实要想开展单细胞研究并不难，今天小编就先带您了解一下最常见的单细胞转录组测序的基本流程，希望您也能尽快的开展起单细胞实验哦！

送样要求

迄今为止，研究的样本类型已有来自肿瘤，干细胞，胚胎，神经系统等多个不同部位，理论上真核生物都能进行10x单细胞RNA测序。在样本选择好之后，实验结果是否理想，很大程度取决于样本的质量，下面是样本制备与运输一个详细的介绍：

如果样本为细胞悬液，需满足下面条件：

1. 细胞直径小于40um（直径超过40um细胞需要制备成细胞核）；

2. 细胞活率大于80%（用台盼蓝或者AO/PI染色检测，官方建议，当单细胞悬液活性低于 70% 时应进行去除死细胞操作）；

3. 单细胞总数大于3万；

4. 细胞成团比例小于10%；

5. 无细胞碎片或其他颗粒杂质；

6. 红细胞比例小于30%；

7. 建议细胞悬液的浓度为700~1200个细胞/ul，体积不小于50ul；

8. 细胞悬液运输，根据细胞类型，一般冰上运输，1h内到达实验室，检测细胞质量，合格后上机；如果是中性粒细胞，常温运输，越快越好。

注意：

1. 重悬单细胞使用的Buffer不能含有钙镁离子和EDTA；

2. 为了保护细胞的活性可以添加BSA和FBS；

3. 常用的Buffer：PBS+0.1%BSA(容易成团细胞推荐)；DMEM+10%FBS(容易死的细胞推荐)。

对于组织样本，需进行以下处理：

1.手术样本取出后，用1xPBS清洗表面血水，修理组织，剪去脂肪，纤维，坏死的组织；

2.建议一次消化的量为黄豆粒大小（100-200mg左右），如果组织偏大需指定区域，否则任意剪取；

3.组织浸没在组织保存液中，4℃保存，冰上运输不能冻。

4.组织离体后48小时内需进行组织解离，尽量在24小时内送至实验室，然后实验室将尽快处理。

实验流程

10x Genomic配套有相应的仪器与分析软件，首先将制备好的单细胞悬液上样到10x Genomic 单细胞捕获系统中，构建带有10x标签的cDNA文库，并在Illumina测序仪上进行短读长NGS测序，得到的数据经Cell Ranger可获得单个细胞水平的基因表达谱和差异分析情况。通过Loupe Browser将数据可视化，使目的基因的表达模式，细胞类型，细胞簇和样本之间比较分析得以直观地展现。

技术原理

Gel Beads（凝胶微珠）

Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，每个微珠表面携带有几十万个Oligo序列，具体结构如上图所示：

Oligo dT序列（图中第一条）由4个部分组成：read1用于上机测序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带不同的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序列进行绝对定量，避免扩增产生偏好；第四段是30bp的ployT，用于捕获有ployA尾的转录本。

捕获和建库

第一步对制备好的单细胞悬液先进行质检，质检合格后与Gel Beads和油分别加入到Chromium Chip G的不同通道，如上图所示，经由微流体“T字”交叉系统形成GEM（油包水结构体系）。一个通道产生8-10万个油滴，其中10%的油滴中含有细胞和Gel Beads。接着细胞裂解，Gel Beads自动溶解释放大量引物序列，与带有PolyA的mRNA进行逆转录，生成带有10x Barcode和UMI信息的cDNA第一链。GEM破碎后，磁珠纯化一链cDNA，并进行PCR扩增，得到稳定的cDNA。然后将扩增后的cDNA进行酶切片段化，筛选合适长度片段，通过末端修复、加A、接头连接Read2测序引物，构建含有P5和P7接头以及双端index的3端表达谱文库（见下图）。

Chromium Chip G（左下）和3‘端建库（右）

测序深度选择

接下来大家会好奇，测序深度为多少合适呢？这个需要权衡需求和成本：对于低频稀有细胞类型，增加测序细胞数，保持低深度测序；对特定细胞，提高测序深度。

一般来说，首次测序量建议25k reads/cell （例：预估捕获10000个细胞，10000*25000=250M reads）。测序结束后，先Cell Ranger对数据进行初步分析，然后根据 Sequencing Saturation的数值判断是否需要加测，以及加测量的多少。

数据分析

分析过程

经过上机测序，拿到原始数据后，会先用Cell Ranger提取细胞的barcode和UMI ，通过STAR 比对到参考基因组，校正barcode ，过滤校正UMI并进行计数，接着根据算法区分包含细胞的 barcode 和背景 barcode，以便提取出真实的单细胞数据，最终得到各细胞的基因表达矩阵。后续用 Seurat做进一步的细胞过滤和标准化，通过降维（PCA）进行聚类（K-Means）、可视化（t-SNE）以及UMAP降维，得到常见的细胞聚类分型结果、Marker 基因及差异表达基因信息。

分析内容

t-SNE/UMAP图：标准化过滤后的数据，使用降维（PCA）和聚类进行细胞分型，根据聚类结果，采用t-SNE/UMAP降维算法，将细胞的分布进行展示，并使用Single Cell Identificator Based on E-test (SciBet)和参考数据集对细胞类型进行注释（如下图）。

t-SNE和UMAP图