公共数据库也能发NG—lncRNA研究新思路

lncRNA功能和机制的研究，成为了现如今科学界的“新宠”。超高的关注率，说明在这个领域能发表一篇高水准的科学论文，需要付出更多的努力和超前的思路。今天，就为大家带来Nature Genetics的一篇关于lncRNA的文章，让小编给大家一步步解释作者是如何通过整合公共数据库的结果，验证了作者的科学假设，发表了大N G。

简单介绍：

论文题目：Modulation of long noncoding RNAs by risk SNPs underlying genetic predispositions to prostate cancer

发表杂志：Nature Genetics

发表年份：2016年10月

影响因子：27.959

这篇文章中，作者并没有自己进行测序，而是用一些新的思路和巧妙的构思，结合了前列腺癌（Prostate Cancer; PC）的SNP数据、表达数据、CHIP-Seq数据等，验证了与前列腺癌显著相关的lncRNA PCAT1，并且探索了PCAT1的调节机制，并且在生物学实验中做了验证。小编给大家分享这篇文章，是想大家可以借助作者的思路，在自己感兴趣的疾病中也能发现到一些感兴趣的现象。因为只凭借老的分析流程，把自己的文章推到一个好的杂志，还是有相当的难度的。闲言少叙，下面小编为大家梳理一下作者的工作流程。

作者从DNA入手，结合之前所发的文章以及GWAS catalog数据库(http://www.ebi.ac.uk/gwas/)的结果，一共筛选出了122个和PC显著相关的SNP位点。由于担心无法找到真正的功能性位点，作者根据这122个SNP的连锁不平衡（LD > 0.8），一共找到了4989个SNP，进行之后的研究。
找到了这些SNP，作者做了三次不同程度的富集分析，逐步的缩小了范围，增加了下一步研究的证据。首先，分析后发现这些SNP显著富集在DNA酶I超敏感位点(DNase I–hypersensitive sites；DHSs)；之后，作者发现这些loci富集于和雄性激素受体(androgen receptor; AR)相关的一些转录因子，而且这些DHXs至少包含一个risk SNP，一半以上都和这些转录因子结合；最后，作者又发现这些位点富集于前列腺癌细胞系的H3K27ac、H3K4me1区域。这些证据证明了这些risk SNP主要是通过调控RNA的表达来影响疾病的发生和发展，而不是在外显子中改变蛋白而影响表型。
使用TCGA数据库的SNP和表达数据，作者对target SNP做了cis-eQTL分析；用intercellular analysis (IFC)，探索包含有risk SNP的enhancer和promoter的潜在相互作用；之后在结合差异基因的分析结果，作者对所包含的lncRNA进行打分，一共找到了45个PC的可能致病的lncRNA，其中PCAT1最为显著。作者之后的研究就都围绕着这个lncRNA进行的。
作者首先通过实验证明了PCAT1和PC的关系，PC患者中这个lncRNA表达升高，减少PCAT1的表达，抑制了肿瘤的生长。和通常的lncRNA文章不同的是，作者没有继续关注这个lncRNA的功能了，而是把目光转向了SNP对这个lncRNA的调节上，大家可以学习一下。
之前的IFC分析表明，PCAT1的promoter区域和一个包含rs7463708的DHS区域存在潜在的相互作用，具有很强的关联，那么可能这个DHS所在区域就是PCAT1的enhancer。根据CHIP-Seq数据，这个区域可结合AR、FOXA1等转录因子。

为了验证这个分析结果，作者就做了3C实验。确实发现了这两个区域的相互作用的信号，并且这个信号在前列腺癌细胞系的信号远远高于其他细胞系。更加有趣的是，也是作者太lucky，荧光报告实验中，携带risk allele T的rs7463078的enhancer功能强大，而non-risk allele G的enhancer和control相比并无区别。

6. 对这一目标区域检查发现，在这个区域可以结合ONECUT2这个转录因子，并且实验证明这个转录因子更加青睐结合rs7463078的T allele的序列。在二氢睾酮（DHT）处理的细胞系中，AR和ONECUT2在这个区域的结合显著升高，当把ONECUT2敲出后，AR在这个区域的结合也显著降低。在之后的免疫共沉淀实验的结果也验证了他们之间的互作关系。PCAT1的表达在激素处理后也会增加，而knock down了ONECUT2，PCAT1的表达就下降了。

7. 对于上游机制的分析已经基本清楚，作者对于PCAT1的下游机制进行了探索。使用RNA Immunoprecipitation (RIP)和multidimensional protein identification technology (MudPIT)实验技术，作者发现PCAT1和AR以及LSD1会形成一个复合体，调节下游基因。这个复合体会特异性结合在GNMT、DHCR24的TSS上，调控下游基因表达。