免疫治疗丨从基因Panel测序数据评估15种肿瘤的TMB分布及与基因间的关系

基因Panel 常称之为“基因包”，也可以称之为“基因组合”，商业化的市场习惯称之为“基因套餐”。就基因Panel 本身来说，其实并没有指明所检测的基因数目应该是多少。几个基因可以是一个 Panel，几十个基因也可以是一个 Panel，几百成千上万个基因也可以是一个 Panel。就 Panel大小来说，不仅需要看检测基因的数目，还需要看基因所覆盖的区域大小。

经过近百年的努力直至近年来以CTLA-4，PD-1/PD-L1通路为代表的免疫检查点抑制剂和CAR-T的成功，让免疫治疗真正登上了肿瘤治疗的舞台。

肿瘤免疫治疗并不直接攻击癌细胞，而是通过激活人体自身免疫系统来抗击肿瘤，具有良好的安全性及耐受性。虽然PD-1/PD-L1抑制剂是一种临床证实有效的治疗手段，然而，目前总体响应率依然只有15-40%1，意味着寻找有效的生物标记物必不可少。

目前，与免疫检查点抑制剂相关的生物标志物有数十种2，其中TMB、PD-L1和MSI/dMMR是经过三期临床试验验证的，在临床上使用比较普遍。

肿瘤突变负荷（TMB）是预测PD-1/PD-L1免疫应答的新兴生物标志物。虽然 TMB 可以通过全外显子组测序或全基因组测序（WES/WGS）进行检测，但从检测成本，检测时间和 FFPE 组织可用性等方面来说，临床更倾向于使用NGS大 panel 来检测 TMB，NGS大panel才是未来的趋势。

那么，NGS大panel与TMB之间有什么关系呢？今天分享的文章系统研究了15种不同癌种间的TMB分布情况，基因的突变偏好，突变丰度，以及比较了NGS大panel 与 WES 的TMB一致性。

▲ NGS大panel进行TMB评估分析

Published6 May 2019 Volume 2019:12 Pages 3401—3409

材料与方法

材料：从TCGA数据库获得15种癌种共6625个样本的WES信息：

▲ 15种癌种共6625个样本

方法：分别使用 F1CDx（324个基因），MSK-IMPACT（468个基因），F1CDx+MSK-IMPACT（525个基因）及WES进行TMB的拟合计算，并评估三个大panel与WES的关联性。

TMB算法：肿瘤细胞基因组编码区的每百万碱基突变数，包括单核苷酸变异（SNVs）和小片段的插入缺失（INDELs ，通常＜20bp）。注意，在F1CDx的方法中，包括同义突变，但是未纳入TSG基因的终止突变和热点驱动突变。本研究的TMB阈值根据F1CDx来划分，分别为：TMB-H（X≥20 突变/Mb）；TMB-M（20＞X≥10 突变/Mb）；TMB-L（＜10 突变/Mb）。

泛癌种TMB panel：计算了15种不同癌种患者样本中每个基因发生突变的比例，并通过降序排列，选择突变频率高的 524个基因组成了泛癌种 TMB Panel。

研究的结论

一、WES水平上TMB的分析：

基于15种癌种WES TMB分析的结果（如图1A和图B所示），发现在不同的癌症类型中TMB分布有很大的差异。

单纯的TMB ≥20 突变/Mb（TMB-H）并不适用于预测每种实体肿瘤类型的免疫治疗效果。针对不同的癌种，其TMB高的阈值设定仍需要更多的临床研究和大量的患者信息的统计。

▲ 图1(A)柱状图显示了WES水平TMB高、中、低的频率

▲ 图1 (B) WES水平15种肿瘤类型的TMB分布的小提琴图

二、WES水平高频突变基因与TMB关系：

在不同的癌种中有不同的高频突变基因，并且在不同TMB范围（高/中/低）中，每种癌种的高发突变基因也不尽相同。

在肺癌TMB值低的患者中，TP53, EGFR, PIK3CA 和KRAS 基因均是常见突变；但是在肠癌患者中，这些基因多发生在TMB高的患者中（如图2所示）。

▲ 图2WES水平肺癌与肠癌中9个基因的突变频率

三、WES水平高频突变位点与TMB关系：

在肺癌患者中，EGFR基因的P.E746_A750del 和P.L858R位点对TMB值有显著的影响，两个位点有突变肺癌病人的TMB数值要低；在肠癌的患者中BRAF（P.V600E）跟TMB值正相关，而在肺癌中与TMB值负相关（如图3所示）。综上，肿瘤中强势的驱动基因的突变，对肿瘤的TMB有显著的影响。

▲ 图3 EGFR及BRAF热点突变对不同癌种的TMB影响

四、基因panel对TMB预测的影响

不可否认，WES是检测TMB的金标准，但是NGS 大panel目前在临床上也可达到与WES的高度相关性，且CDS区域应>0.8Mb（最好是1.0Mb）。3

文章采用从TCGA数据库获得的6625个WES样本信息，采用F1CDX，MSK-IMPACT，F1CDX+MSK-IMPACT的基因panel对样本的TMB进行拟合计算，结果得出：基因数量越多，panel测得的TMB值与WES测得的TMB值拟合度越好。为了验证这个观点，文章从WES所包含的基因中，随机抽取了300，400，500个基因，然后分别对样本的TMB进行拟合计算。和之前panel得出的结论一致，基因数越多的panel（包括优化的泛癌种524 基因Panel），计算所得的样本TMB值与WES所得TMB值拟合度越高（如图4所示）。

▲ 图4 基因数越多的panel，TMB与WES的拟合度越高

虽然本文是计算机模拟的结果，但是，之前的文章也证明了，计算机模拟的结果其实与真实世界的研究结果关联性也是比较高的。4

近年来，大量肿瘤分子靶向药物及免疫检查点抑制剂不断上市并在临床实践中取得显著疗效，证明了靶向治疗/免疫治疗的科学性和可行性，为广大肿瘤患者带来了福音，开起了肿瘤治疗的“精准化”时代。

与此同时，涌现出越来越多的靶向药物作用靶点及耐药靶点（如EGFR，KRAS，BRAF，FGFR，NTRK等）与免疫治疗相关生物标志物（TMB，MSI，MMR，HLA等），促进了肿瘤基因检测产品由之前的单基因PCR产品逐步向多基因联合的NGS产品发展，标志着：肿瘤基因检测NGS大panel才是真正的未来和趋势，尤其是肿瘤免疫治疗如此火热的情境之下，NGS大panel才是真正能解决临床问题的方案，选择靠谱的NGS 大panel很重要。

参考资料：

1.Yarchoan M, Hopkins A, Jaffee EM. Tumor mutational burden and response rate to PD-1 inhibition. N Engl J Med. 2017;377(25):2500.doi:10.1056/NEJMc1713444

2.Havel Jonathan J,Chowell Diego,Chan Timothy A,The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy.[J] .Nat. Rev. Cancer, 2019, 19: 133-150.

3.Büttner Reinhard,Longshore John W,López-Ríos Fernando et al. Implementing TMB measurement in clinical practice: considerations on assay requirements.[J] .ESMO Open, 2019, 4: e000442.

4.Endris Volker,Buchhalter Ivo,Allgäuer Michael et al. Measurement of tumor mutational burden (TMB) in routine molecular diagnostics: in silico and real-life analysis of three larger gene panels.[J] .Int. J. Cancer, 2019, 144: 2303-2312.

5.Zhenwu Xu,Jiawei Dai,Dandan Wang et al.Assessment of tumor mutation burden calculation from gene panel sequencing data. oncotarget and therapy，2019