WGCNA+多组学+体外实验=单基因模板文章！

大家好，我是蟀小伙儿，单基因文章想必大家都不陌生，近年来，单基因的文章层出不穷，内容也是五花八门，今天蟀小伙儿就和大家一起研究一篇发表在Oncoimmunology上的经典单基因文献，这篇文章内容非常丰富，但整体难度不是很大，希望能给想做单基因项目的小伙伴提供一些灵感～

一、背景

①口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）最常见的亚型，其转移和复发率高，且对传统化疗耐药。

②CD8 + T 细胞免疫疗法目前已被批准用于治疗复发/转移HNSCC/OSCC患者，但效果有限。

因此，探索出可以预测OSCC患者预后和免疫治疗反应的候选标志物很有必要。

二、数据来源

①GEO：GSE78060,GSE13601,GSE41613,GSE42743，GSE30784

②TISCH：GSE103322（HNSCC单细胞RNA-seq数据集）

③UCSC，UALCAN，TIMER2，MEXPRESS数据库：TCGA-HNSCC，RNA-seq（3级），临床数据和DNA甲基化数据

④TCGA-GDC和cBioPortal：体细胞突变和CNV数据

三、流程图

四、结果简述

一、WGCNA确定核心模块

如图a所示，作者通过WGCNA算法，筛选出与pN stage和CD8+T细胞密切相关的红色模块，接着对模块里的基因进行GO和KEGG功能分析，GO结果表明:该模块与ECM,TGF-β受体信号通路的调控以及EMT过程相关，KEGG结果表明:该模块基因主要富集于ECM-受体互作相关通路（图b-c）。

二、YKT6的确定及列线图的构建。

作者在GSE13601中进行差异分析，筛选出在肿瘤样本中上调的差异基因，与红色模块的前100个基因取交集后，得到29个差异基因，接着进行生存分析，筛选出在GSE42743，GSE41613，TCGA三个数据集中均有预后意义的6个基因，SWSFS算法表明，YKT6和PLAU是构建模型的关键基因，鉴于YKT6的重要性更大，因此作者选取了YKT6作为本次研究的关键基因（图a-d)。

接着，作者进一步研究了YTK6的预后价值，生存分析结果表明，YTK6是预后的危险因素（图a-d)，单因素和多因素Cox分析表明，YTK6具有独立的预后意义（图e），Meta分析进一步验证了上述的结果（图f）。

同时，基于多因素Cox的结果，作者进一步构建了列线图，校准曲线表明，该列线图的预测性能良好，且大于YTK6和传统肿瘤分期的预测效能，图(g-k)。

三、OSCC/HNSCC患者中YTK6的表达水平分析

如图a-b所示，作者首先探究了YKT6的表达与临床病理特征和HNSCC/SCC亚型的相关性，结果表明，YTK6与大多数临床特征均有显著相关性，且与HNSCC/SCC的免疫亚型密切相关。

接着作者探究了YTK6的表达与肿瘤分级，HPV状态，TP53突变状态，HNSCC不同组织亚型的关系（c-h)。结果表明:肿瘤分期高，HPV阴性，TP53突变的患者YKT6的表达通常更高。此外，一些预后较差的组织亚型如Mesenchymal和Non-immune等亚型患者的YKT6表达更高，这与前面生存分析的结果相一致。如图j-k所示，YKT6在肿瘤样本中的表达显著升高，这与差异分析结果一致。

接着作者通过ESTIMATE计算出肿瘤纯度和免疫评分，并探究了YKT6的表达与肿瘤纯度，免疫打分的相关性。结果表明，YKT6的表达与肿瘤纯度正相关，与免疫评分呈负相关，这也解释了YTK6高表达患者预后差的可能原因（图l-m）。

最后，基于多组学数据，作者探究了YKT6表达水平与CNV和甲基化的相关性。CNV结果表明，YTK6高表达患者更容易发生拷贝数扩增，低表达的患者更容易发生缺失（图n-o），YTK6在染色体中的位置如图p所示。甲基化结果表明，YTK6在肿瘤组织中的甲基化更低，且YKT6的表达水平与甲基化水平呈负相关（图q-r）

综上所述，YKT6过表达与HNSCC/OSCC进展、复发、较差预后、CNV扩增，低甲基化等密切相关。

四、Western Blotting（蛋白免疫印迹）和IHC

Western Blotting结果表明，YKT6在肿瘤组织中的表达水平较高（图a）。IHC结果表明，YKT6蛋白表达水平随pN分期增加而增加，且在肿瘤组织中的水平较高（图b-d）。与未发生转移的样本相比，发生转移的样本中YKT6的蛋白表达水平更高（图e-f）。

如图g-i所示，YKT6蛋白水平随OSCC恶化程度的增加而增加。

五、GSVA富集分析

作者根据YKT6的表达量，将患者分为高低表达组，如下图所示，YKT6高表达组显著富集在EMT、TNF-α，TGF-β信号通路、缺氧、肿瘤通路等通路。YKT6低表达组则显著富集在T细胞和B细胞受体信号通路。这表明YKT6在OSCC恶化中起到重要作用。

六、细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验表明，YKT6的下调会抑制细胞迁移（图a-d），YKT6的缺失则会降低细胞迁移和侵袭能力（图e-j）。如图k-m所示，OSCC细胞敲除YKT6后MMP9蛋白表达水平降低。YKT6下调表达则会导致TGF-β1分泌减少（图n-p）。总的来说，YKT6与OSCC细胞迁移和侵袭密切相关。

七、YKT6高表达与CD8+ T细胞表达负相关

如图所示，TIMER2结果表明YKT6高表达与HNSCC患者中CD8+ T细胞水平负相关（图a）。此外，YKT6的表达差异的CNV预示着不同的CD8+ T细胞水平（图b）。另外三种免疫浸润分析的结果也与TIMER2一致（图c-e）。此外，IHC结果表明，随着YKT6蛋白表达升高，CD8蛋白水平降低（图f-h）。YKT6表达与CCL5,CCR5,CCR2,CXCR3和CXCL9表达水平负相关（图i-k）。综上所述，YKT6是肿瘤微环境的潜在生物标志物。

八、YKT6低表达预测更好的ICB反应

如图i-n所示，作者进一步研究了YKT6与趋化因子及其受体，免疫检查点表达的相关性，结果表明，YTK6与这些因子大多负相关，其中包括PD-1,PD-L1,CTLA-4等因子。

如图a所示，YKT6的表达与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）比例，免疫检查点水平，HLA丰度，APC共刺激和T细胞共刺激等因素呈负相关，同时，YKT6表达与TIDE评分正相关（图b），YKT6高表达的患者对ICB反应较差（图c），在GSE30784,GSE41613的研究表明，YTK6与MHC,EC,IPS评分均呈负相关，与SC正相关（图d-e）。