基因共表达网络分析（WGCNA）教你寻找已知功能基因的调控基因

研究背景

雌激素是一种甾体激素，对雌性繁殖有广泛的影响。在生殖期，雌激素的合成主要在卵巢卵泡的体细胞（卵泡膜细胞，TCs和颗粒细胞，GCs）中。然而在哺乳动物和鸟类中其合成位置并不相同。在哺乳动物中，TCs从头产生雄激素，GCs进行雌二醇转化。然而由于未知的原因，在鸟类中TCs产生睾酮和雌二醇（一种雌激素）。

CYP19A1编码芳香酶，是负责雌激素的生物合成的关键步骤。哺乳动物牛中，雌二醇在卵泡选择后的分化阶段达到高峰，而在家禽鸡中，CYP19A1 在选择阶段的黄色小卵泡中达到最高水平。目前，禽类的卵泡选择机制和两种主要细胞TCs,GCs在卵泡中的功能尚不清楚。而哺乳动物牛的卵巢发育被很好的研究，因此通过比较转录组利用基因共表达网络分析（WGCNA）有利于深入研究鸡中卵巢发育机制。

WGCNA基本分析流程：

1. 构建基因共表达网络：使用加权的表达相关性。

2. 识别基因集：基于加权相关性，进行层级聚类分析，并根据设定标准切分聚类结果，获得不同的基因模块，用聚类树的分枝和不同颜色表示。

3. 如果有表型信息，计算基因模块与表型的相关性，鉴定性状相关的模块。

4. 研究模块之间的关系，从系统层面查看不同模块的互作网络。

5. 从关键模型中选择感兴趣的关键基因，或根据模块中已知基因的功能推测未知基因的功能。

研究方法

测序平台：Illumina sequencing (Sequencing Mode: Paied-end, 2 ∗ 150 bp)

研究结果

1、基因共表达网络构建和模块划分

根据基因表达加权相关性进行聚类分析，设置每个模块中最少包含30个基因， chicken_SYF形成23个模块，cow_D 形成17 个模块，cow_S形成18 个模块。图1为chicken_SYF模块聚类树，不同的颜色代表不同的模块。

图1 基因共表达网络的可视化表示

2、chicken_SYF与牛分化期的卵泡网络模块高度相似

利用基因重叠分别检测chicken_SYF与cow_D和cow_S一致的模块，图2-A显示chicken_SYF（红色线）与cow_D（蓝色线）高度保守。以CYP19A1基因表达为性状，并将模块基因与该性状的关联通过量化来定义基因显著性（Gene Signiﬁcance，GS）。

图2 物种间模块相似性和chicken_SYF模块-性状相关性

3、确定基因模块与性状的关联性

模块-性状关系分析发现，两个模块与CYP19A1基因表达显著相关：具有4588个注释基因的天蓝色模块（turquoise module）(r=−0.86, P=0.006)和具有1980个注释基因的淡刚蓝模块（lightsteelblue1 module ）(r=0.96, P=2E-04)。

图3 chicken_SYF中模块-性状相关性

4、关联模块中关键基因的功能分析

A1为天蓝色模块基因的网络描述，A2为淡刚蓝模块基因的网络描述，其中红色表示关键基因。

图4 鸡模块基因网络及其功能分析

表1显示天蓝色模块中大多数基因参与基因的转录调控（包括表观遗传调控）、细胞黏附以及雄激素和雌激素受体信号通路。淡刚蓝模块中大多数基因参与了基因转录调控以及蛋白质的磷酸化和去磷酸化。这些关键基因中包含两个重要的转录因子（ESR2, ALX1）。

表1 天蓝色模块和淡刚蓝模块中排名前10的关键基因

5、ESR2可能是调控CYP19A1基因的转录因子

之前研究表明CYP19A1在牛的GCs中表达，而在鸡的TCs中表达。通过计算这两个物种GCs和TCs中差异表达基因（DEGs），将其与JASPAR网站预测转录因子进行比对，最终获得两个可能的转录因子ESR2和Npase2（表2）。结合WGCNA分析得到的鸡的与CYP19A1表达相关的关键基因（表1）也包含ESR2，最终认为ESR2是CYP19A1潜在调控因子。

表2 通过JASPAR网站预测转录因子

6、RT-PCR检测 ESR2和CYP19A1表达

鸡中CYP19A1在小黄卵泡发育阶段（TCs）达到表达高峰，并且在GCs中无表达（图6-A）。ESR2在TCs中表达显著高于GCs（图6-B），实验初步证明ESR2 与CYP19A1存在相关性。

图6 鸡中卵泡发育阶段CYP19A1表达模式和小黄卵泡中关键基因表达情况

7、鸡中ESR2抑制CYP19A1基因表达

构建CYP19A1启动子片段与荧光素酶融合表达载体，利用荧光素酶报告基因在293T（图7-A）和DF-1(图7-B)细胞中检测CYP19A1启动子片段（cp2-cp5）活性，发现其均具有启动子活性。

图7 CYP19A1启动子片段活性

在图7的基础上于293T细胞中分别将启动子片段cp2与荧光素酶共表达载体PGL3-cp2与不同浓度的ESR1表达载体质粒pcDNA-ESR1共转发现荧光素酶活性显著下降（图8-A），不同CYP19A1启动子片段的表达载体与ESR1表达载体质粒pcDNA-ESR1共转，发现ESR1可以降低其荧光素酶活性。因此确定ESR1抑制CYP19A1表达。

图8 ESR2对CYP19A1启动子片段活性的影响

总结

1 物种间相似生物过程的比较特别是对一个研究较少的物种与一个研究的较好物种进行比较，不仅有助于了解两个物种之间的进化保守性，而且还能为研究较少物种的特定生物过程的机制提供新的见解。

2 该研究基于WGCNA比较牛和鸡的卵泡选择过程。鸡的小黄卵泡和牛卵泡分化阶段之间观察到高度的种间模块保守性。该结果将有助于利用牛卵泡发育信息了解鸡卵泡的发育机制。

3 “卵泡选择”一词用于哺乳动物和鸟类，这表明在不同物种中有相似的过程。结果表明，其发生在牛和鸡的不同阶段。如图9所示，牛卵泡选择后的分化阶段实际上与鸡的小黄卵泡选择阶段相当。

图9 鸡和牛卵泡发育比较示意模型

4 该研究中，在鸡卵泡的TCs中确定了ESR2作为CYP19A1潜在的调节因子，因为其与CYP19A1具有类似的表达模式，并且鸡中ESR2直接抑制CYP19A1的表达。

文献索引

Jing R, Gu L, Li J, et al. A tranomic comparison of theca and granulosa cells in chicken and cattle follicles reveals ESR2 as a potential regulator of CYP19A1 expression in the theca cells of chicken follicles[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2018, 27: 40-53.

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1744117X18300170?via%3Dihub=

转自：派森诺