知识分享：琼脂糖凝胶电泳

实验原理

琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物，以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下，忽略DNA分子携带的电荷，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。

不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。

核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子；聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果最好，且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶，可以分离丌同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大，带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 6V/cm。而对于大片段电泳，可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳，可使用聚丙烯酰胺凝胶。

核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉，但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以综合考虑，多采用 TBE 缓冲液。

核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性，现在大多选择EB替代品进行试验，比较常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整体效果都若于传统的EB。

材料、试剂及器具

1、材料

合适的Marker（分子量标准）；DNA 样品

2、试剂

加样缓冲液（6x或10x）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）。

3、器具

（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。

（2）凝胶成像系统或紫外透射仪。

实验过程

1、按所分离的 DNA 分子的大小范围，选择合适的比例的凝胶，称取适量的琼脂粉，放到一锥形瓶中，加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。待胶液却至 60℃左右，在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。

2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

3、待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。