五分钟带你了解ATAC-seq测序

ATAC-seq,英文全称Assay for Targeting Accessible-Chromatin with high-throughout sequencing，中文可理解为结合高通量测序技术的靶向开放染色质的研究方法。这个方法是2013年由斯坦福大学的William J. Greenleaf和Howard Y. Chang实验室共同开发的用于研究染色质可及性/开放性的方法。目前，通过ATAC-seq方法发表的文章数量呈持续增长中。

什么是染色质可及性/开放性？

真核生物中的核小体是染色质的基本结构单位。DNA与组蛋白结合后形成核小体，核小体再进一步折叠压缩后最终形成染色质。DNA的复制和转录都需要将染色质紧密结构打开，从而允许调控因子结合DNA。这部分被打开的染色质，就叫开放染色质（Accessible-Chromatin）。开放染色质允许调控因子结合的特性称为染色质的可及性（Chromatin Accessibility）。简而言之，染色质可及性/开放性是指某个时间点同时进行转录的DNA区域。

实验原理

ATAC-seq利用DNA转座酶技术实现染色质可及性分析。DNA转座酶可以将自身结合的一段序列随机插入到基因组中。在ATAC-seq试验中，细胞或组织样本在核质分离后，将细胞核单独收集在一起，并通过转座酶对核内的染色质进行打断。紧密包裹的染色质DNA不会受到转座酶的打断，而开放区域的染色质DNA会被转座酶随机插入并打断。将这些打断后的DNA收集在一起进行后续的建库、测序、分析，即可得到开放染色质的信息。

ATAC-Seq可以解决什么问题？

1）转录因子的调控差异

ATAC-seq研究染色质的可及性，即某个时间点同时进行转录的DNA区域。这部分区域的染色质DNA被打开，因此可以被DNA聚合酶、转录因子、转录调控因子所识别、调控。在实验设计上，可以比较DNA聚合酶、转录因子、转录调控因子在不同类型样本中的转录调控差异。这些转录的差异又可以为下游的蛋白调控提供信息。

例如：在某些疾病、肿瘤组织，根据RNA-seq的结果提示样本转录表达的差异，在这些情况下，ATAC-seq可以从源头，即基因转录的情况提供信息，从而有可能证明转录差异的表达是由转录起始的某些调控因子引起的。

（2）Motif对应转录因子的检索

ATAC-seq不仅可以在已知转录因子缺陷的实验组中进行染色质调控差异的研究。它还能为双盲实验提供信息。因为ATAC-seq研究的是开放染色质的区域，这些区域的序列中包含大量的转录起始的Motif信息。这些Motif信息可以在数据库中找到对应的调控转录因子，从而为下游实验设计提供信息。

文章案例

案例一研究癌细胞和正常细胞的染色质开放性差异。

Guler, G.D., et al., Repression of Stress-Induced LINE-1 Expression Protects Cancer Cell Subpopulations from Lethal Drug Exposure. Cancer Cell, 2017. 32(2): p. 221-237 e13.

文章是Active Motif与合作客户Genentech Inc分子肿瘤学部的Marie Classon发表于Cancer Cell的文章。Marie等人研究了药物耐受的病人在临床用药后仍然存活的癌细胞的的染色质状态。通过ATAC-seq技术检测开放染色质的水平，结果发现在药物治疗后仍然存活的癌细胞表现为染色质开放状态受到抑制。结合ChIP-seq的实验，染色质上组蛋白H3K9和H3K27的甲基化水平增加了。进一步研究表明H3K9的甲基化水平的增加主要集中在LINE-1元件上。

案例二：体细胞重编程过程中转录因子对染色质开放性的影响

Ward, C., et al., Fine-Tuning Mybl2 Is Required for Proper Mesenchymal-to-Epithelial Transition during Somatic Reprogramming. Cell Rep, 2018. 24(6): p. 1496-1511 e8

2018年英国伯明翰大学的Paloma Garcia实验室对体细胞重编程过程的调节因子进行了研究。众所周知，2012年时任京都大学的山中伸弥教授因发现了体细胞重编程因子而获得了诺贝尔生理或医学奖。Paloma教授的研究表明与现在的重编程调节因子的作用相反，转录因子Mybl2蛋白的过度表达会抑制体细胞重编程过程。他们通过ATAC-seq实验观察了Mybl2-AmCyan实验组和AmCyan对照组在体细胞重编程过程中的染色质开放性变化。有趣的是，从总体上观察单个测序峰中调节因子Oct4、Sox2、Oct4-Sox2和Klf4的结合Motif数量的变化时，只有Sox2的结合Motif数量在Mybl2过表达时有明显的减少（图C）。但在缩小观察窗口区间后再观察时发现除了Klf4，其余的都发现在Mybl2过表达时有显著的减少（图D）。这表明过表达Mybl2基因可能影响Sox2和Oct4与特定染色质区域的结合。通过数据统计发现Mybl2过表达后的Peak数较对照组有明显减少（图E），表明染色质变得更加封闭和紧凑。最后，通过对序列峰中的Motif反向检索对应的转录因子时，发现实验组和对照组的序列峰的Top 3 Motif对应的转录因子是不同的（图F，G），提示了Mybl2的过表达能改变体细胞重编程的过程。

怎么样？现在对ATAC-Seq有了解了吧 !

参考文献

[1] Buenrostro, J.D., et al., Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods, 2013. 10(12): p. 1213-8.

[2] Guler, G.D., et al., Repression of Stress-Induced LINE-1 Expression Protects Cancer Cell Subpopulations from Lethal Drug Exposure. Cancer Cell, 2017. 32(2): p. 221-237 e13.

[3] Ward, C., et al., Fine-Tuning Mybl2 Is Required for Proper Mesenchymal-to-Epithelial Transition during Somatic Reprogramming. Cell Rep, 2018. 24(6): p. 1496-1511 e8.