单细胞测序：实验设计和分析方法（一）

2014年，单细胞测序被列为《Nature Methods》年度最重要的方法学进展。通常说的单细胞测序，是指单细胞的mRNA测序。随着单细胞RNA测序技术日渐成熟，可预计将来会有越来越多的单细胞测序应用于科研和临床。细心的读者可能发现，转录时空已经推送了很多单细胞测序领域的文章。针对火热的单细胞测序，我们将对单细胞测序的特点、实验设计、分析方法将一一进行介绍，分享给大家。

1-RNA测序特点

a) “大体积”（Bulk）RNA-seq

2000年以来的主要技术突破（替代microarray），现已广泛使用

以大量细胞来检测基因的平均表达水平

可应用于比较转录组学，如不同物种的同种组织样本

可应用于基因定量

不适合用于研究具有异质性的系统，如早期发育，复杂组织（脑）

不能表征基因表达的随机性（ stochastic）本质

b) 单细胞RNA测序

2009年汤富酬等人年首次报道的新技术

直到约2014年，由于新的单细胞测序方法提出和测序成本的大幅下降，单细胞测序才开始广泛使用

可定量单细胞基因表达水平，并可获得一群细胞的基因表达水平分布

对于研究转录组在单细胞水平特异性变化等问题非常有用，如细胞类型鉴定、细胞应答异质性、基因表达随机性、细胞间的基因调控网络

大多数情况下，现有的数据分析方法需要调整要才能使用，或者开发新的分析方法

不同的单细胞测序建库方法有：SMART-seq2(2013), CEL-seq（2012）, SCRB-seq(2014), Drop-seq（2015）

2-单细胞测序实验流程

总体来说，单细胞测序的方法与大体积RNA测序方法类似，对于具体实验流程的讨论，本文不在此赘述。总结如下

3-单细胞测序数据分析流程

第一步(黄色）：跟一般高通量测序一样，检查测序序列质量，序列回帖，检查序列比对质量；

第二步（橘黄色）：需要结合现有的RNA-seq分析方法和新的方法来处理单细胞测序技术上的不同。最大的不同点在于normalization；

最后：对单细胞RNA-seq的数据解读应使用特为单细胞开发的分析方法。

我们将在下期详细介绍以下各步骤涉及到的分析工具和方法

4-单细胞测序的挑战

与“大体积”RNA-seq不同，单细胞RNA-seq的主要区别在于一个测序文库代表一个细胞，而不是大量的细胞（Drop-seq例外，其利用细胞UMI和分子UMI将大量细胞建成一个文库）。因此，须加倍关注单细胞测序文库之间的不同。文库间的差异性主要体现在：

扩增效率（Amplification），差异可达100,000倍

基因“丢失”（dropouts），即一些基因在某些细胞中有表达，但是在另一些细胞中无法检测到

这两种差异都是由于起始材料太过稀少（RNA分子从一个细胞而来）而产生的。提高转录本捕获效率和降低PCR扩增偏好性是亟待解决的问题，因此这个领域的研究也相当活跃。

5-单细胞测序的对照

为了更好估计和消除单细胞测序文库间的技术（系统）误差，现有两种定量标准被广泛采用，即spike-ins和UMIs。使用这两种对照是为了辅助规范（normalization）不同细胞间的基因表达水平。

Spike-ins

Spike-ins是已知浓度的外源RNA分子。在单细胞裂解液中加入Spke-ins后，再进行反转录。最广泛使用的Spike-ins是External RNA Control Consortium (ERCC)提供的合成spikes。其包含96个不同长度和GC含量的mRNA分子 (Jiang et al. 2011)。但是spike-ins的使用浓度通常很高，结果会占据很大比例的测序reads。最新的Drop-seq技术也还没不能加入spike-ins。

UMIs

另一种标准化方法是使用 Unique Molecular Identifiers (UMIs)(Kivioja et al. 2012). UMIs是一种随机条形码（barcode）序列，长度在4-20 bp之间。在扩增步骤之前（通常在反转录期间），UMIs被添加在每个转录本cDNA的3’或5’端。之后，对转录本末端进行靶向测序。这些barcodes使得在扩增步骤之前，可以对转录本进行定量。虽然UMIs消除扩增偏好性的效果非常好，但是不合适用于研究基因异构体和allel特异表达。

更多内容，下回分解

参考文献：

Tang, Fuchou, Catalin Barbacioru, Yangzhou Wang, Ellen Nordman, Clarence Lee, Nanlan Xu, Xiaohui Wang, et al. 2009. “mRNA-Seq Whole-Transc riptome Analysis of a Single Cell.” Nat. Methods 6 (5): 377–82.

Picelli, Simone, Åsa K Björklund, Omid R Faridani, Sven Sagasser, Gösta Winberg, and Rickard Sandberg. 2013. “Smart-Seq2 for Sensitive Full-Length Transc riptome Profiling in Single Cells.” Nat. Methods 10 (11): 1096–8.

Hashimshony, Tamar, Florian Wagner, Noa Sher, and Itai Yanai. 2012. “CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.” Cell Rep. 2 (3): 666–73.

Macosko, Evan Z, Anindita Basu, Rahul Satija, James Nemesh, Karthik Shekhar, Melissa Goldman, Itay Tirosh, et al. 2015. “Highly Parallel Genome-Wide ex pression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.” Cell 161 (5): 1202–14.

Stegle, Oliver, Sarah A Teichmann, and John C Marioni. 2015. “Computational and Analytical Challenges in Single-Cell Transc riptomics.” Nat. Rev. Genet. 16 (3): 133–45.

Jiang, Lichun, Felix Schlesinger, Carrie A Davis, Yu Zhang, Renhua Li, Marc Salit, Thomas R Gingeras, and Brian Oliver. 2011. “Synthetic Spike-in Standards for RNA-seq Experiments.” Genome Res. 21 (9): 1543–51.

Kivioja, Teemu, Anna Vähärautio, Kasper Karlsson, Martin Bonke, Martin Enge, Sten Linnarsson, and Jussi Taipale. 2012. “Counting Absolute Numbers of Molecules Using Unique Molecular Identifiers.” Nat. Methods 9 (1): 72–74.