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2021
07-14

如何获得circRNA?

2017年发表的文章《CircView: a visualization and exploration tool for circular RNAs》曾对近几年发表的circRNA文章数目进行统计。统计发现早在20世纪90年代circRNA的文章就有报道,但是低迷很长一段时间。

2013年预测circRNA工具的文章发表,使得2013年成为circRNA研究的转折点,当年发表的文章17篇,随后2014年26篇文章,2015年57篇文章,2016年135篇文章,按照这种趋势作者预测2017年超过200篇,大家可以发现,2017年circRNA文章远远超过200篇(见图1)。由此可见circRNA是继mRNA,miRNA和lncRNA之后,一个新的研究热点。

图1 circRNA文章数量统计图

首先来认识一下circRNA:

circRNA是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。对RNase R不敏感,比线性RNA更加稳定;具有进化保守性,表达具有组织和时空特异性。

其功能:

1)circRNA可作为miRNA的海绵:竞争性结合miRNA,发挥ceRNA的调控功能,调控基因表达;

2)circRNA结合RNA结合蛋白(RBP)以形成RNA-蛋白复合物(RPC),调控线性亲本基因的转录;

3)编码功能:circRNA具有内部核糖体进入位点(IRES),能合成多肽。

目前对于二代测序circRNA的获得主要有两种方式,一种通过构建去除rRNA的链特异性文库的方式;另一种是构建去除rRNA,去除线性化RNA的链特异性文库的方式。其详细的文库构建流程分别见图2-1,图2-2:

在进行circRNA研究时,通过哪种方式来获得circRNA一直困扰着各位科研工作者,下表是对两种方式的一个简单比较,各位可根据自身实际的研究目的进行选择。

接下来和大家分享一篇基于去除rRNA的链特异性文库进行分析的文章:

A genome-wide landscape of mRNAs,lncRNAs, and circRNAs during subcutaneous adipogenesis in pigs

中文题目:猪皮下脂肪形成过程中mRNA,lncRNA和circRNA的表达图谱

皮下脂肪作为能量代谢和内分泌系统的关键部分,在猪的生长和肉质方面起着重要作用,然而不同类型RNA如mRNA,lncRNA和circRNA在皮下脂肪细胞的分化过程中的作用仍不清楚。本研究对中国白猪皮下脂肪不同的分化阶段(即第0天(D0),第2天(D2),第4天(D4)和第8天(D8))的细胞进行转录组测序,分析mRNA,lncRNA和circRNA在脂肪细胞分化过程中的表达特征。

1、RNA-Seq的特征

数据控制后,样本 D0,D2,D4和D8各获得总clean reads 数目分别为155981654,137762268,168562368和119115476,其Q30均大于94.80%;样本中分别97.49%,97.60%,97.66%和97.88%的clean reads比对到参考基因组上,BWA-MEM用于序列分裂比较以准确鉴定circRNA; 每个样本的比对率均超过99.91%(见表1)。

表1 脂肪细胞分化四个阶段的测序数据

2、脂肪细胞分化过程中基因的表达谱

脂肪细胞分化的四个阶段共获得16192个mRNA,5615个lncRNA和8623个circRNA。新lncRNA和circRNA中占比最大的是LincRNA和经典的circRNA(图3a-b);其中9191个mRNA,430个lncRNA(包括208个注释的lncRNA和222个新的lncRNA)和2172个circRNA被鉴定为可靠表达的基因(图3c)。

图3 基因表达表征描述

在分化期间,五个比较组(D2 vs D0,D4 vs D2,D8 vs D4,D4 vs D0和D8 vs D0)中鉴定差异表达的(DE)基因:共2758个mRNA,230个lncRNA和1760个circRNA被定义为DE基因(图4a-c)。其中各组中差异表达的RNA详情见图4d。

图4 差异表达(DE)基因及其表达模式图

3、差异表达基因GO分析

五个比较组中(D2 vs D0, D4 vs D2, D8 vs D4, D4vs D0和D8 vs D0)DE基因(包括mRNA,lncRNA和circRNA)的GO分析详细信息见图5。

图5 GO分析图

4、脂肪细胞分化过程中共有DE基因分析

脂肪细胞分化的各个阶段分别与分化初始D0相比,鉴定到共有的DE基因中394个mRNA,37个lncRNA和297个circRNA,见图6a-c。这些共有的DE基因在脂肪细胞分化不同阶段的表达情况见图6d-f。

共有的DE基因GO分析表明,主要富集的条目包括:

1)mRNA:细胞粘附,细胞分化和脂质代谢过程;

2)lncRNAs的靶基因:有机酸代谢过程,脂质代谢相关过程和单一生物过程;

3)circRNA的亲本基因:组蛋白甲基化,蛋白烷基化和调节细胞对刺激的响应等,见图6g。

图6 细胞分化过程中共有的DE基因的表达分析

5、构建lncRNA-mRNA共表达网络

为了鉴定与脂质代谢和细胞分化过程相关的关键lncRNA,选择132个与这两个过程相关的共有的差异表达mRNA和36个共有的差异表达lncRNA构建mRNA-lncRNA共表达网络。研究发现20个lncRNA与PPARG(一种关键的脂肪细胞分化标记基因)共表达,4个lncRNAs包括MSTRG.6375,SMIM4,MSTRG.88924和MSTRG.65804与其他脂质代谢相关标志基因如APOE,LIPE和ADIPOQ共表达,见图7,表明这些lncRNA可能在调节脂肪合成中起重要作用。

图7 与脂质代谢和细胞分化过程相关的lncRNA-mRNA共表达网络图

结 论

本文研究了猪皮下脂肪细胞分化期间mRNA,lncRNA和circRNA的表达谱,并鉴定了大量的DE基因。这些结果将为脂肪细胞分化过程中各种RNA的表达水平提供了全面的基础,同时为研究猪皮下脂肪形成的分子调控机制提供一种新的思路。

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参考文献:

[1] Feng J , Xiang Y , Xia S , et al. CircView: a visualization and exploration tool for circular RNAs[J]. Briefings in Bioinformatics, 2017.

[2] Liu X, Liu KQ, Shan BS, et al. A genome-wide landscape of mRNAs, lncRNAs, and circRNAs during subcutaneous adipogenesis in pigs [J]. Journal of Animal Science and Biotechnology (2018) 9:76.

最后编辑:
作者:萌小白
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