研究开放染色质，你在用哪一种

根据前文表观遗传学研究你知道多少？——ATAC-seq可知，开放染色质的研究，对于寻找转录前调控核心因子至关重要。本次小编重点给大家介绍几种利用现有测序技术快速获取开放染色质区域的全部信息。

1、最直接的开放染色质区域检测技术——DNase-seq技术

2008年面市的DNase-seq技术是比较早出现的，基于二代测序平台的开放染色质区研究技术。该技术使用核酸内切酶DNase I。此种酶类无法酶切被核小体或其他蛋白保护的DNA片段，优先切割开放染色质区域，因此开放染色质区通常也是DNase I的超敏感位点。对于此类核酸内切酶，只要酶切条件控制得当（例如酶切时间，温度，酶的浓度等），开放染色质区不会被DNase I酶切成单碱基状态，而只是将开放区DNA酶切成片段，为后续的测序工作和分析环节提供可能。但是该技术存在明显的不足：

a需要大量细胞

b样本制备耗时

c需要精确控制酶切条件，实验复杂

实验流程

DNase I酶切 ——收集酶切后片段（开放染色质区）——建库 ——上机测序

2、最间接的开放染色质区域检测技术——MNase-seq技术

2008年面市的MNase-seq是使用微球菌核酸酶（microccocal nuclease，MNase）这种同时兼具内切和外切酶活性的核酸酶。我是科普小贴士：凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。凡能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶，凡能从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。因为兼具外切酶和内切酶的活性，MNase能逐渐一步一步的切碎不被核小体或其他蛋白保护的DNA，只有被核小体或其他蛋白保护的DNA不被酶切降解。所以该技术主要用于核小体位置研究，开放区信号本身是缺失的（被酶切完全降解，测序检测不到）。因此，MNase-seq技术只能间接检测开放染色质区，并不是最好的开放区染色质检测技术。并且该技术存在其他明显的不足：

a需要的细胞数量较多，约10-20百万个；

b样本制备费时；

cMNase酶偏好切割基因组中AT富集区域；

d基因组的某些区域比其他区域对该核酸酶消化更敏感，但具体的机制目前仍不清楚。

实验流程

MNase酶切——收集酶切后片段（核小体外DNA）——建库 ——上机测序

3、最局限的开放染色质区域检测技术——ChIP-seq技术

ChIP-seq技术是将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。该技术仅支持研究目标蛋白在基因组DNA上的开放染色质结合位点序列研究，要求有明确感兴趣的目标蛋白，其次是该目标蛋白有较为成熟的chip4.级别的抗体，因此可使用该技术的物种和蛋白类型非常有限；另一方面，由于免疫共沉淀实验的复杂性，需要较长的时间摸索实验条件，以期实验的成功和获得足量的DNA片段进行测序和分析，因此ChIP-seq被认为最局限的研究全基因组范围内的开放染色质技术。

实验流程

免疫共沉淀（ChIP）——富集目的蛋白——结合的DNA序列——纯化DNA片段——建库测序

4、最高噪音但实验相对简单的开放染色质区域检测技术——FAIRE-seq

FAIRE-seq是一种基于酚氯仿抽提原理为基础的获得开放染色质区的检测技术。主要原理是使用超声破碎经甲醛固定后染色质，得到片段化的的染色质，然后通过酚氯仿抽提，上层水相中即认为是潜在的开放染色质区，然后针对开放染色质区进行建库测序，获得开放区信息，但是该技术最大的不足点在于：

a原本状态的染色质结构复杂，超声打断DNA片段大小不易控制，因此检测精度较差。

b非开放区噪音高，导致信噪比低，数据解读困难，影响数据的可靠性

c甲醛固定时间不易把握

实验流程

甲醛固定染色质 ——超声波打断——酚氯仿提取——富集上层水相DNA—— 建库测序

5、最新最优的开放染色质区域直接检测技术——ATAC-seq技术

2013年面市的ATAC-seq技术指的是利用DNA转座酶可以把DNA序列从染色体的一个区域搬运到另一个区域的特性，用改造后的Tn5转座酶，将转座DNA设计为测序接头，从而直接将测序接头引入开放染色质中，进行捕获测序。转座酶主要切割的是基因组上的开放染色质区，而核小体致密排列的闭合染色质区，是无法被切割的。转座酶切割后，对酶切DNA片段进行富集纯化，就实现了对基因组开放区的获取，另一方面，转座酶还可以切割开放区染色质附近的核小体间连接区DNA，因此又可以同时获得核小体印记信息。简单言之，就是ATAC-seq技术可以同时得到DNase-seq和MNase-seq两种技术的结果信息。