葡萄美酒夜光杯：GBS-GWAS定位葡萄风味基因

“葡萄美酒夜光杯，欲饮琵琶马上催。”葡萄自古以来就是非常重要的水果，无论是直接食用、酿酒还是制成葡萄干，都深受世界各地人们的喜爱，同时葡萄（包括晶莹剔透的葡萄美酒）也经常成为文学家、艺术家笔下描绘的对象。时至今日，人们对葡萄的青睐有增无减，于是培育出更加美味的葡萄也就成了当务之急。对于那些重要的果实性状，若能将它们在基因组上进行定位，育种工作将会事半功倍。对于自然群体的性状定位而言，GWAS（Genome-wide association study，全基因组关联分析）是最直接、快捷的方法，而GBS简化基因组测序能够更进一步为性状定位提供便利。河南科技大学的研究者利用GBS-GWAS方法对葡萄的多种性状对应的QTL在基因组上进行了定位，未来的葡萄会不会风味更佳？我们可以一起期待一下。

深受人们喜爱的葡萄

1.材料与方法

研究者收集了179个品系的葡萄，并对这些葡萄品系进行了精细的表型鉴定。鉴定的表型包括果实发育周期（BDP）、果穗大小（CS）、果穗密度（CD）、果实重量（BW）、果肉质地（BFT）、果实颜色（BC）、果实形状（BS）、果实风味（BF）八种性状。

不同品系的葡萄取嫩叶提取DNA后使用ApeKI酶进行单酶切GBS测序，测序数据比对参考基因组和变异识别使用SOAP软件完成。得到变异信息后，使用ADMIXTURE对群体结构进行分析，并使用PHYLIP构建系统发育树。

进行GWAS分析之前，为了保证分析的精度，对SNP进行过滤，去除缺失比例超过0.05以及最小等位基因频率（MAF）小于0.05的SNP。研究者在比较了多种软件后，最终选定了R包GEMMA作为GWAS分析软件，使用标准线型混合模型进行分析，并使用GEC软件进行阈值计算和数据校正。

2.结果与分析

2.1 GBS测序与群体遗传结构

GBS测序共产生了43.71 GB数据，得到的SNP经过质量过滤后，共有32311个高质量SNP用于后续分析。这些SNP标记覆盖所有19条染色体，标记间的平均距离为14.26 kb。

SNP标记在基因组上的分布

使用ADMIXTURE软件使用不同K值对群体结构进行分析，交叉验证误差（cross validation error）分析显示K=8为最优结果。群体结构显示所选择的植物材料没有存在明显的家系分化，适宜进行后续的GWAS分析。系统发育树结果显示所选择的群体可以分为8个亚群，验证了群体结构分析中K=8为最优结果的结论，选择K=8的Q矩阵进入后续的关联分析。同样，PCA结果也验证了所选的材料没有出现明显的群体结构分化，适宜进行GWAS分析。

所选材料的ADMIXTURE、系统发育树与PCA群体结构分析结果

2.2 GWAS分析

将SNP标记与性状进行关联后，在所有8种性状中有6种性状发现了显著关联的SNP。与果实颜色、果实发育周期、果穗大小、果实重量、果肉质地以及果实风味相关的SNP标记数量均在1-5个之间，其中与果实重量相关的4个SNP标记分别分布在3条不同的染色体上，而与果实颜色相关的5个SNP标记分布在同一条染色体上。对这些标记周围约1Mb区域内的基因进行分析，从功能角度搜索可能与性状相关的候选基因。

分析找到了一些曾经在其他研究中得到验证的基因，部分SNP标记与之前发现的位点所在的位置存在一定的差异，而另外一些SNP标记则位于之前没有报道过的区域。葡萄的果实颜色曾经被研究认为受到染色体2上MYB转录因子家族控制，而本次研究找到的SNP标记附近找到了基因mybA3，属于MYB转录因子家族，但在之前的研究中未提及mybA3这个特定基因的作用。与果实重量相关的SNP标记发现了一个在18号染色体上曾报道过的位点，以及在17和19号染色体上的两个新位点。

利用GWAS分析，研究者找出了与葡萄的多个性状相关的SNP标记以及对应的候选基因，这项研究增进了对葡萄这一重要作物遗传层面的了解，为未来的育种工作提供了新的思路。

六种性状的GWAS关联分析结果

靠谱er点评

GWAS是对自然群体进行性状定位的重要工具，但需要对每个个体进行测序，测序量大、需要的预算高是GWAS得到更广泛应用所面对的障碍。而GBS简化基因组能很好地解决这一问题，本研究中GBS测序得到了高质量的SNP标记，使得GWAS分析对各个性状都筛选到了对应的显著关联的标记。同时，材料的选取对于GWAS分析的成功进行也必不可少，本文不仅选取了179个不同基因型的品系，并且群体结构分析表明所选取的材料中并不存在明显的聚类，即没有显著的群体结构分化，适宜进行GWAS分析。最后，GWAS的分析方法选择也很重要，本文使用了PLINK、TASSEL、GEMMA、EMMAX四款软件利用不同的数学模型进行GWAS分析，从各个软件的Q-Q plot来看，GEMMA能够最好地匹配本研究的数据。本文最终选择使用R包GEMMA作为分析软件使用混合线性模型进行分析，得到了较为理想的结果。

但是利用GBS测序也会有一些弱点，比如：1. 标记平均密度为14.26 Kb，而分析之后LD衰减值值为16.6 Kb，也就是标记密度不够导致不能捕获到所有的LD block，靠谱er推测这点可能是作者GWAS分析后没有进行LD block进行候选基因筛选的原因；2. 另外，进行关联分析时候部分性状虽然有关联到SNP标记，但是SNP支持度偏少，导致无法准确判断是真实关联还是假阳性SNP。而重测序则可以完美解决这几个问题，事实上，本文合作单位农科院郑州果树所也继续收集资源，利用重测序进行葡萄进化和GWAS研究，成果在本文online两个月后发表在Nature communication上（Liang Z, Duan S, Sheng J, et al. Whole-genome resequencing of 472 Vitis accessions for grapevine diversity and demographic history analyses[J]. Nature communications, 2019, 10.），感兴趣读者可继续深究对比两文的差异。

参考文献

Guo D L, Zhao H L, Li Q, et al. Genome-wide association study of berry-related traits in grape [Vitis vinifera L.] based on genotyping-by-sequencing markers[J]. Horticulture research, 2019, 6(1): 11.