Notch信号通路在癌症中的作用
分析基因在癌症中作用的文章，一般都是分析单基因或者基因家族，今天让我们一起通过2021年6月发表在Cancers (IF:6.639)上的文章“A Comprehensive Bioinformatics Analysis of Notch Pathways in Bladder Cancer”，来看看如何分析信号通路在癌症中的作用吧~
期刊简介
要素拆解
题目：膀胱癌 Notch 通路的生物信息学分析
疾病：膀胱癌（Bladder Cancer，BCa）
物种：人类
数据来源：TCGA-BLCA, GTEx-BLCA
背景知识
Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，Notch信号参与癌症生物学的许多方面，包括血管形成、肿瘤免疫和癌症干细胞的维持。此外，Notch在不同癌症和同一肿瘤的不同细胞群中，同时发挥致癌和抑癌的作用。哺乳动物有4个Notch受体基因（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）和5个配体基因（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged 1、Jagged 2）。
Notch 信号通路的机制主要分为 经典通路和 非经典通路。
经典的 Notch 信号通路
又称为CBF-1/RBP-Jκ依赖途径, Notch通路不是通过激酶磷酸化逐步活化传递信号，它是Notch通过三步蛋白酶切水解，把有转录调节活性的Notch蛋白片段（NICD或ICN）释放出来，再与转录因子CSL结合，调节下游基因表达。Notch的受体和配体都是膜蛋白，介导的是两个细胞相互靠近接触之后的活化效应，而不是由分泌型的蛋白作为配体。
非经典的 Notch 信号通路
又称为CSL非依赖途径,可以在没有配体的情况下启动，不涉及Notch受体的裂解，Notch受体的胞内区域与细胞内的蛋白结合，从而影响胞质内的转录因子。癌细胞和T细胞中，非经典的 Notch 信号通路可能与NF-κB通路和PI3K-AKT通路之间的形成串扰。
Notch信号的在癌症干细胞、血管生成、上皮间质转化 (EMT)、肿瘤免疫和耐药性中发挥重要作用，但对单个肿瘤类型的特异性较低。因此，研究Notch信号在特定肿瘤中的生物学作用非常有意义。
数据解读
本文一共有9个图6个表10个附图17个附表，数据量非常庞大，现仅针对主图进行分析和复现。作者首先对比膀胱癌和正常组织中NOTCH通路相关基因的差异（图２），分析其相关性和ROC曲线（图３），分析与淋巴细胞的相关性（图4）和免疫调节基因的相关性（图５），分析各基因的总体生存和疾病特异性生存（图６和图７），并进行了GSEA分析（图8），还通过meta分析、身体图和免疫组化图进一步证明基因的可靠性（图9）。
图1| 实验设计流程图
图2 | 对照组和BCa中目标基因的表达水平
图3| Notch通路相关基因的相关性及诊断价值
图4| Notch因子与淋巴细胞的相关性
图5 | Notch通路与BCa免疫调节基因表达的关系
图6| 目标基因的总体生存(OS)分析
图7| 目标基因的疾病特异性生存(DFS)分析
图8| GSEA分析
图9| meta分析，身体图和免疫组化图
复现工具
仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products）
TISIDB数据库（http://cis.hku.hk/TISIDB/）
GeneMANIA数据库(http://genemania.org/)
GSCALite数据库 (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/)
Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/）
GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)
HPA数据库 (https://www.proteinatlas.org/)
文章复现
图1| 实验设计流程图
此图清晰的展示了文章的分析流程，可使用PowerPoint绘制。
图2 | BCa和对照组中目标基因的表达水平
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图2A
仙桃学术（https://www.xiantao.love/），点击【生信工具】
【高级版】 → 【立即使用】
（注：免费版和基础版都可以进行统计和可视化，由于高级版功能最全，这里选择高级版作为范例）
【表达差异（挑）】 → 【表达差异】→ 【非配对样本】 → 选择【TCGA_GTEx-BLCA】→ 输入目标分子【NOTCH1】 → 【确认】即为图2A的第1个小图 → 【保存结果】或下载结果
图2A的其他小图只需改变目标分子即可。
（注：仙桃学术可以选择【TCGA_GTEx-BLCA数据集】或【TCGA -BLCA数据集】，但目前只能比较Normal vs Tumor,暂时还不能比较control-GTEx vs control-TCGA vs tumor,所以图片与原文中略有差异）
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图2B
直接拖到页面的最下方，进入百度云下载“XENA-TCGA_GTExRNAseq”的数据
下载“ESCA_rnaseq_tpm.txt”
因为“ESCA_rnaseq_tpm.txt”的基因名都是Ensemble编号的，所以这里需要ID转换一下。
新建一个Excel表格，输入NOTCH通路的11个基因名，保存为“ID.xlsx”
【基础绘图】 → 【简易ID转换（人源）】 → 上传“ID.xlsx” → 【确认】 → 【CSV表格下载】
利用ensemble ID在“ESCA_rnaseq_tpm.txt”中寻找到对应的基因表达谱。
确保ensemble ID无误后，将第一列替换为基因名，并将文件保存为“heatmap_data.xlsx”
【表达差异（挑）】 → 【复杂热图】 → 上传“heatmap_data.xlsx” → 【确认】 → 【保存结果】或下载结果即为图2B
图3| Notch通路相关基因的相关性及诊断价值
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图3A
新建一个Excel表格，将“heatmap_data.xlsx”的数据转置粘贴，并删除第一列
将文件保存为“correlation_data.xlsx”
【基础绘图】 → 【相关性热图-原始矩阵】 → 上传“correlation_data.xlsx” → 【确认】 → 【保存结果】或下载结果即为图3A
图3B用仙桃暂时还画不了，以后会慢慢更新功能，敬请期待哦~
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图3C
【临床意义（靠）】 → 【ROC曲线】 → 输入目标分子“NOTCH1” → 【确认】 → 【保存结果】或下载结果即为图3C的第一个小图
图3C的其他小图只需改变目标分子即可。
图4| Notch通路相关基因与淋巴细胞的相关性
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图4A
进入TISIDB数据库（http://cis.hku.hk/TISIDB/） → 输入目标分子“NOTCH2” → 【Submit】
选择【Lymphocyte】
选择BLCA一列，将各基因的图片拼接起来即为图4A
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图4B-F
根据颜色深浅，选择X轴为【BLCA】,Y轴为【Tem_CD8】 → 【Plot】即为图4B
更换Y轴，即可得到图4C-F
图5| Notch通路与免疫调节基因表达的相关性
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图5A
继续在TISIDB数据库中，选择【Immunomodulator】
在【Immunoinhibitor】下，选择BLCA一列，将各基因的图片拼接起来即为图5A
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图5C
根据颜色深浅，选择X轴为【BLCA】,Y轴为【TGFBR1】 → 【Plot】即为图5C1
更换Y轴，即可得到图5C2-C8
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图5B
在【Immunostimulator】下，选择BLCA一列，将各基因的图片拼接起来即为图5B
图6| 目标基因的总体生存分析
回到仙桃学术-生信工具
【临床意义（靠）】 → 【预后分析】 → 【KM曲线图】 → 选择【TCGA-BLCA】 → 输入目标分子“NOTCH1” → 【确认】 → 【保存结果】或下载结果即为图6A
更换目标分子，即可得到图6B-K
图7| 目标基因的疾病特异性生存(DFS)分析
按照图6的方法，将预后参数改为【DSS】并【确认】即为图7
图8| GSEA分析
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图7A
进入GeneMANIA数据库（http://genemania.org/） → 输入目标分子 → 点击放大镜 → 点击⊙ → 点击左下角图标
选择与NOTCH通路相关的功能，即得到图8A
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图7B-E
回到仙桃学术-生信工具
【表达差异（挑）】 → 【差异分析】 → 【筛选分子】 → 选择【TCGA-BLCA】 → 选择【临床-status】并分为【Normal】和【Tumor】两组 → 【确认】，等待5-10分钟
在【历史记录】中，待状态为【完成】时，即可下载结果
用Excel打开下载的结果，仅保留【gene_name】和【log2FoldChange】两列，并另存为“GSEA_data.xlsx”
【分析工具】 → 【功能聚类（圈）】 → 【GSEA富集】 → 【GSEA分析】 → 上传“GSEA_data.xlsx” → 选择【c2.all.v7.2.symbols.gmt】 → 【确认】，等待1-2分钟
在【历史记录】中，当状态为【完成】时，即可下载结果
【分析工具】 → 【功能聚类（圈）】 → 【GSEA富集】 → 【GSEA可视化】 → 选择刚刚做的GSEA富集分析 → 输入基因集ID【KEGG_CELL_CYCLE】 → 【确认】，即为图8B
在基因集ID输入相应的名称，即可得到图8C-E
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图7F
进入GSCALite数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/) → 输入11个NOTCH通路相关基因，用逗号隔开 → 搜索
选择【TCGA-BLCA】 → 选择【Pathway Activity】 → 【Start Gene Set Analysis】→ 等进度条跑完，点击左侧【TCGA Cancer】 → 【Pathway Activity】
【Heatmap percentage】下载即为图8F
图9 | BCa与非癌组织中代表性基因的 Oncomine 的meta分析，以及目标基因表达水平的身体图
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图9A-C
进入Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/）→ 输入【NOTCH3】 → 【Search】 → 输入【Infiltrating Bladder Urothelial Carcinoma】 → 【Search】 → 勾选有“Infiltrating Bladder Urothelial Carcinoma vs. Normal”的数据集 → 【Compare】→ 出现的图片即为图9A
图9B和图9C的做法类似，仅改变基因名即可。
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图9A1 ，A2，B1，B2，C1，C2
GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn) → 输入【NOTCH3】 → 【GoPIA!】
在绿色人体的找到的【Bladder】即为图9A1，在红色人体的身上找到【Bladder】即为图9A2
图9B1，B2，C1，C2的做法类似，只是更换基因名即可。
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图9A3
进入HPA数据库 (https://www.proteinatlas.org/)→ 输入基因名【NOTCH3】 → 【Search】
点击【Tissue】的图片
【TISSUES】 → 【URINARY BLADDER】
点击图片并保存即为图9A3
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图9A4，B3，B4
【PATHOLOGY】→ 【CANCER】→ 【UROTHELIAL CANCER】
找到合适图片 → 点击图片并保存即为图9A4
图9B3，B4，的做法类似，只是更换基因名即可。
本文亮点
1.不同于传统的单基因或基因家族的分析，本文研究了NOTCH通路相关的基因，不仅研究思路非常新颖，而且对临床也非常有借鉴价值。
2. 综合多个数据对NOTCH通路在膀胱癌中的作用进行全面分析，涉及NOTCH通路相关基因的差异表达、临床诊断价值、与淋巴细胞和免疫调节基因的相关性、基因网络分析、与其他癌症相关通路的相互作用，还综合了meta分析、身体图和免疫组化图，一共有9个图6个表10个附图17个附表，全面又详细。
3. NOTCH通路在肿瘤中起着重要作用，在NOTCH通路中筛选出与膀胱癌最相关的基因，比如NOTCH4是最有希望的诊断标志物，NOTCH3是最关键的致癌基因，HES1是最具保护性的基因，对膀胱癌的发生、发展、转移和肿瘤免疫都非常有意义。
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