这是一篇“一看就懂”的单细胞测序文章！

今天跟大家分享一篇单细胞数据分析加简单验证实验的生信高分文章。对！没有其它分子类型或多组学数据联合分析，如果仅用scRNA数据发表10+文章？下面我们来一探究竟！文章题目：Single-cell analysis of human testis aging and correlation with elevated body mass index.

研究背景

衰老的男性表现出生殖健康下降；然而，在分子和基因组水平上，人们对睾丸衰老知之甚少。该文章利用单细胞RNA-seq分析了44,000多个来自年轻和老年男性的睾丸细胞，探究了衰老对生殖细胞发育和睾丸体细胞的影响。

研究思路

基于单细胞数据比较了老年组和年轻组的每个主要睾丸细胞类型在衰老过程中的转录变化，揭示人类睾丸衰老的一系列分子机制。

研究结果

1.样本及数据信息

作者收集了八名老年(>60岁)和四名年轻(17-22岁)的男性的睾丸组织进行10x单细胞转录组测序。，在组织学上，所有年轻的睾丸都观察到成熟精子的发生，然而老年组有三个睾丸样本发现了明显的生精受损。12个样本scRNA-seq共有44,657个细胞(年轻的13,156个细胞，老年的31,501个细胞)通过了质量控制并进行了分析。基于细胞类型特异性标记基因的表达，确定了体细胞和生殖细胞类型，包括：支持细胞、巨噬细胞、内皮细胞、间质细胞、管周细胞、平滑肌细胞、未分化和分化精原细胞、精母细胞和减数分裂后精子细胞。

2.精原细胞衰老的分析

为了了解生殖系在衰老过程中的变化，作者对生殖细胞群进行了进一步分析。首先根据标记基因将生殖细胞发育分为7个阶段（精原干细胞SSCs，分化精原细胞，早期初级精母细胞，晚期初级精母细胞，精子圆细胞，延长型精子细胞和长形精子细胞）。然后分析了每个样本中各类生殖细胞亚型的占比，其中来自老年组的3个睾丸样本中，仍观察到中等数量的未分化SSCs，而进一步发育的生殖细胞类型高度减少，表明生殖细胞分化受到衰老的异质性影响。为了进一步探索睾丸老化和衰老导致的男性亚生育的潜在分子机制，作者将老年样本分为两组：组织学上精子发生正常的为老年组1，精子发生明显缺陷的为老年组2。

接下来作者通过免疫荧光染色发现，精原干细胞SSCs的丰度在年轻组和老年组1之间没有变化，但在老年组2中显著下降，表明衰老相关的生精功能缺陷可能是由于SSCs的数量减少。最后，作者进行了异种移植实验，以评估老年精原细胞对年轻精原细胞的定植潜力。结果发现异种移植2个月后，三组患者的平均移植效率大致相当。与年轻组相比，老年组的克隆形成潜力的差异更大。观察人精原细胞集落形成情况还发现，尽管年轻组和老年组1没有显著变化，但老年组2的细胞数明显低于年轻组和老年组1，这表明老年组2的精原细胞扩张能力下降。

3.睾丸体细胞的转录变化及体细胞与生殖细胞相互作用

为了了解体细胞在衰老过程中的变化，作者探究了每种体细胞类型中的差异表达基因（DEG）。作者重点关注了两种及两种以上的体细胞类型共有的DEG。对共有的上调基因和下调基因分别进行功能富集分析，发现上调基因显著在炎症相关的GO term中显著富集。其中TIMP1(炎症网络中的一种分泌蛋白)，IL6ST，IL6受体和IFITM2/3的表达从年轻组到老年组1再到老年组2逐渐变化，即与亚生育相关的基因在老年组1中表现出中度失调，在老年组2中表现出更强的失调。然后作者对TIMP1染色进行了实验验证。总之，这些结果表明炎症是睾丸体细胞老化的共同特征。

然后，作者基于CellChat分析探究了细胞间的相互作用。结果发现年轻和老年睾丸之间的相互作用强度从年轻组到老年组1再到老年组2依次减弱。特别是，与年轻组相比，老年组2中SSCs与体细胞的相互作用次数和相互作用强度较低。例如，在老年组2中，支持细胞(配体)和SSCs(受体)之间的激活素信号通路减少。值得注意的是，激活素信号可能有助于调节SSC的自我更新和分化。支持细胞(配体)和分化的精原细胞(受体)之间的KIT信号通路减少，这一通路也已知在维持SSCs自我更新和分化的平衡中发挥关键作用。此外，与免疫系统相关的信号通路在衰老过程中也发生了变化，包括老年组巨噬细胞中MIF信号通路的减少和补体信号通路的增加。这些结果表明，睾丸体细胞信号在衰老过程中发生了对生殖细胞发育不利变化。

4.支持细胞在衰老过程中表现出炎症和代谢紊乱

为了探索支持细胞在衰老过程中的变化，作者对支持细胞群进行了进一步分析。拟时序分析发现来自老年组2的支持细胞位于轨迹的末端，老年组1的细胞沿轨迹分布。结合拟时序和差异分析发现，分化末端的支持细胞中上调的基因富集了与炎症相关的GO term，下调的基因富集了与代谢相关的GO term。为了验证结果，作者进行了免疫荧光(IF)染色和蛋白质印迹分析，发现老年组2的支持细胞中HMGCS2和PSAT1的表达显著减少。通过支持细胞标记SOX9染色发现与年轻组相比，老年组1和老年组2的支持细胞数量都显著下降。支持细胞标记SOX9和生殖细胞标记DDX4共同染色发现年轻组的生殖细胞与支持细胞的比率与老年组1相似，而老年组2的比率显著下降，表明老年组2的支持细胞存在功能缺陷。总之，这些结果表明，支持细胞的丧失和代谢功能的减弱都可能影响老年男性的精子发生。

5.间质细胞在信号、睾酮和发育特性方面表现出失调

同样的方法，作者又探究了间质细胞特异表达的基因及功能通路。发现老年间质细胞上调基因在很大程度上与平滑肌收缩、生长抑制和活性氧(ROS)有关。然后同样用免疫荧光验证了间质细胞标记物（Cyp11a1）和关键蛋白（Ptch1）的表达。接下来，作者通过Cyp11a1的IF染色量化了三组间质细胞的数量，观察到在衰老过程中间质细胞数量显著减少。最后作者进行功能验证实验，通过体外培养睾丸组织，用刺激睾酮产生的激素处理，评估衰老的间质细胞产生睾酮的能力。结果发现，同样重量的组织在老化过程中含有较少的间质细胞，而且与年轻组相比，老年组2的睾丸素显著下降，而GSEA分析没有得出与类固醇生成相关的途径，这表明老年间质细胞总睾酮产量的下降更有可能与间质细胞数量的减少有关，而不是单个间质细胞睾酮产量的不足。

6.睾丸管周细胞，内皮细胞和巨噬细胞在衰老过程中的分子及功能特征

为了探索其它类型细胞在衰老过程中的变化，同样的分析（差异分析，功能富集分析，免疫荧光实验）分别对管周细胞（TPCs），内皮细胞和巨噬细胞又来一遍。分析结果就是：（1）与年轻组相比，在两个老年组样本的TPCs中观察到炎症相关通路失调；细胞周期及细胞死亡相关基因表达上调，平滑肌收缩相关基因表达下调；TPCs细胞数量明显增加。得出的结论是衰老的TPCs显示生精小管壁的完整性及收缩能力受损，导致腔内精子运输的能力失调。（2）在老年组的内皮细胞中上调的基因在“抗原处理和呈递”GO term中显著富集，表明内皮细胞参与了睾丸免疫动态平衡。下调基因在“血管发育”和“血管生成调节”GO term中显著富集。考虑到血管系统在精子发生中的关键作用，这个结果表明，内皮细胞可能在一定程度上导致了老年组2的生精失败。（3）老年组的巨噬细胞表现出抗原提呈减少，对未折叠蛋白的反应增加（内质网应激）的特征。

7.老年男性的生精模式与他们的BMI显著相关

上述结果可知，老年组1和老年组2在生理学和基因组学特征上有明显的不同，接下来作者又基于患者临床特征进一步寻找可能影响他们生育能力的相关因素。结果发现包括低BMI和高BMI的所有年轻组供者都显示出正常和成熟的精子生成。而生精正常的老年第1组的供者的BMI都很低(<27)，而所有来自老年第2组的供者的BMI都较高(>30)。该结果根据BMI状态对老年捐赠者进行了划分，并在高BMI(>30)的老年捐赠者中观察到了明显的失调。

研究亮点

（1）研究了每个主要睾丸细胞类型在衰老过程中的转录变化，揭示了人类睾丸衰老的一系列分子机制；

（2）该研究提供了关于衰老可能如何与其他同时存在的因素(如BMI)相结合来影响人类睾丸中的生殖细胞和支持体细胞的重要见解；

（3）揭示了诊断睾丸老化的潜在生物标志物，并为与衰老相关的不育症的潜在治疗提供了方向。

小编有话说

这篇文章的分析方法非常简单，就是一些常规的单细胞分析方法。研究思路就更简单了，就是分别探究睾丸重要细胞类型的分化轨迹，基因表达特征及分子机制，再进行实验验证。文章的主要亮点就在研究切入点比较新颖，不是基于疾病与正常的常规分组，而是基于基于年轻和老年的分组研究衰老对生殖的影响。另外，用到的自测单细胞的人睾丸样本还是比较珍贵的，无疑也是文章的加分项。

文章分析思路简单，单细胞分析方法也是常规的，你有心动吗？前提是你得会这些分析，才有可能利用合适的思路，发表自己的单细胞高分文章！

转自：小张聊科研