金葡菌抑制免疫炎症反应的新机制

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原体，前者可引起强烈的免疫炎症反应而促进自愈，后者则通常缺乏炎症反应。目前对金葡菌抑制免疫反应的机制研究尚且不足。近期，浙江大学动物病理实验室谭勋老师团队在 Cells 期刊发表了题为“大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 通路导致牛乳腺上皮细胞发生不同免疫炎症反应”的文章。研究团队采用转录组学分析后发现，大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 下游调控基因表达，与大肠杆菌不同，金葡菌缺乏激活 Nrf2 的能力。进一步研究表明，Nrf2 信号通路决定了病原特异性免疫反应。与在其他细胞中的发现不同，Nrf2 正向调控奶牛乳腺上皮细胞应对病原体的免疫反应。本研究发现金葡菌可抑制 p62 介导的非经典 Nrf2 信号通路活化，揭示了金葡菌抑制乳腺组织发生免疫炎症反应的原因，为防控金葡菌性乳腺炎提供了新的靶点。

研究方案

本项研究分离培养了原代奶牛乳腺上皮细胞 (bMECs)，分别用灭活的大肠杆菌和金葡菌刺激后进行转录组测序分析，发现大肠杆菌可诱导多条炎症信号通路活化，但金葡菌差异调控的基因与炎症反应无关。进一步分析发现，大肠杆菌可诱导多条 Nrf2 (Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2) 下游基因转录，而金葡菌对 Nrf2 下游基因的表达无显著影响。在此发现的基础上，作者探究了 Nrf2 对免疫炎症反应的调控作用，并探讨了金葡菌阻断 Nrf2 通路活化，进而抑制免疫炎症反应的机制。

图 1. 研究方案示意图。

研究过程及结果

转录组学揭示大肠杆菌和金葡菌差异调控免疫反应及 Nrf2 下游基因表达

对差异表达基因进行基因功能分类 (Gene Ontology, GO) 功能富集和 KEGG Pathway 分析发现，在大肠杆菌刺激的细胞内，引起的上调基因主要富集于先天免疫反应通路，包括了 NF-κB、Toll 样受体、NOD 样受体等，下调基因主要与细胞增殖、细胞死亡和代谢过程有关。但是在金葡菌刺激的细胞中，只检测到 16 条差异表达基因。由于差异表达基因过少，无法进行 GO 功能富集分析。对转录组学结果进一步分析发现，大肠杆菌可引起 Nrf2 下游多条基因表达上调，而金葡菌不能引起 Nrf2 下游基因改变。

图 2. 大肠杆菌上调基因的功能注释和通路分析。

大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 通路

为了进一步验证大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 通路，作者观察了两种病原刺激下 Nrf2 的入核情况。发现大肠杆菌和 LPS 均可引起 Nrf2 通路活化，相反，金葡菌无法活化 Nrf2 通路。

图 3. 金葡菌抑制 Nrf2 活化。

Nrf2 调控乳腺上皮细胞的免疫反应

作者利用 LPS 刺激的炎症细胞模型，观察敲低 Nrf2 对炎症反应的影响。发现敲低 Nrf2 后，LPS (Lipopolysaccharides) 诱导的炎性细胞因子转录和 NF-κB 通路均受到显著抑制，提示 Nrf2 正调控乳腺上皮细胞的免疫炎症反应。随后，作者构建了带有入核序列的 Nrf2 过表达质粒 (3xNLS-Nrf2) 并转染乳腺上皮细胞，发现激活 Nrf2 后金葡菌诱导的致炎因子表达显著上调，这一结果反向证明，金葡菌无法诱导强烈的的免疫反应与 Nrf2 活化不足有关。

图 4. Nrf2 对 LPS 和金葡菌诱导的免疫反应的影响。

金葡菌损伤非经典 Nrf2 通路抑制其活化

已知氧化应激可激活 Keap1-Nrf2 信号通路 (经典通路)。作者发现，金葡菌抑制 Nrf2 活化并不是因为活性氧 (ROS) 生成不足而造成的。除了经典通路外，Nrf2 活化还受 p62/SQSTM1 非经典通路调控，作者检测了两种病原感染后 p62/SQSTM1 的蛋白表达水平和磷酸化水平，发现金葡菌抑制 p62/SQSTM1 在丝氨酸 349 位点的磷酸化，相反，大肠杆菌和 LPS 可促进 p62 磷酸化。以上结果表明金葡菌可阻止 p62/SQSTM1 依赖的 Keap1 降解，从而阻断非经典 Nrf2 通路活化。