干货|宏转录组全类型样本准备都在这里

肠道微生物研究方兴未艾，重磅研究成果硕果累累。这不，又有肠道菌群微生物的研究发表在Nature[1]和Science[2]上了，而地球微生物组计划的第一颗果实也在Nature[3]上发布。

继2016年5月13日美国宣布启动“国家微生物组计划”以来，微生物组研究已经成为了各国科学家及政府关注的焦点；而随后2017年12月20日重磅推出的“中国科学院微生物组计划”，再次将我国的微生物组研究推上高潮[4]。

在这样的浪潮中，我们该如何把握时机，飞得更high？奥维森基因想你所想，已为你备好微生物宏转录组宝典，专精宏转录组样本准备，助力微生物组的研究。

1宏转录组之我见

宏转录组学（Metatranomics）兴起于宏基因组（Metagenomics）之后，从整体水平上研究某一特定环境，特定时期群体生命全部基因组转录情况以及转录调控规律，揭示微生物在不同环境压力下的适应机制，探索环境与微生物之间的互作机理。其适用范围包括：人体微生态、环境、工业、农业等领域。

2常见样本类型

Metatranomics的应用非常广泛，媲美于Metagenomics，涉及各大样本类型，包括:

1. 环境微生物组，如土壤、水体、污泥、空气；

2. 肠道微生物组，如胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、粪便，小鼠肠道，反刍动物瘤胃等；

3. 工业微生物组，如传统发酵液、生物冶金或活性物质等。

然而宏转录组研究虽然火热，但是其样本准备一直是限制并提取获得高质量RNA的主要因素，为了提高其样本提取成功率，特附上宏转录组RNA样本制备方法：

1土壤样本

不同地域土壤，极低海拔或高海拔地区；

不同处理土壤，如追肥、足灌、耕作方式、污染程度等；

根系及非根系土壤，研究根际及非根际，根表及根内微生物等。

取样方法

（1）采样所用工具、塑料袋或其他物品都要事先灭菌，或用采取的土壤擦拭。

（2）取5-10 cm处普通土壤，针对际土壤，需采集20 cm深的土壤于50mL的无菌管里，多点采取重量相当的土壤进行混匀，去除杂质后再取一定量土壤装入无菌管，每个样品取样2-10g，迅速放在液氮里冻存。

（3）密封后用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

注意事项：为防止交叉污染，不建议使用自封袋取样。

2污泥样本

不同类型污泥，如水池、沼气池、生物电池等；

不同处理污泥，如地域、深度、污染程度等。

取样方法

（1）活性污泥样本取自活性污泥装置中，一般取样量大于20ml，将其置于无菌管中，建议立即提取后-80℃保存。

（2）海洋沉积样本根据研究目的进行取样，一般建议取1kg 以上的沉积物装入塑料袋中，低温运输并尽快进行提取-80℃保存。

注意事项：活性污泥样本等一般建议及时提取，样本体积较大，长时间-80℃保存，主要是冻融提取比较困难，加大了实验工作量及难度。建议提取后保存RNA即可。

针对固体样品可以直接冻存送样。建议使用RNA保护剂保存，具体方法如下：

（1）每克土壤加入2~2.5倍体积保护液，如1g土壤中加入2~2.5 ml保护液。注意：若对象是底泥沉积物样品，每克湿重样品请加3倍体积保护液。

（2）涡旋或手工摇匀，使样品与溶液混匀，保护液液面应当高于土样层。根据情况-20℃、4℃或室温保存。

（3）提取样本RNA时，2500×g离心5min，移除Tube管中的保护液，收集土样。

备注：常用保护液为LifeGuardTM Soil Preservation Solution或RNAprotect Bacteria Reagent。

3水体样本

不同类型，如海水、污水、养殖水等水体；

不同处理，如处理时间、深度、受污染程度等水体。

取样方法

（1）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45 μm的滤膜，取样体积大于5L。

（2）对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤。

（3）将滤膜冻干后，用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

4人、动物样本

不同类型，如胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、粪便等；

不同处理，如正常与患病、不同年龄、不同药物处理时间等。

取样方法

动物组织样本，采用RNase-free水或1×PBS缓冲液（pH7.4）清洗，可用RNAlater保存剂，或液氮速冻，-80℃以下的环境中保存，或干冰运输。

所有宏转录组样本类型，提取完毕，RNA总量需大于2 μg，OD260/280值为1.6~2.3，有明显主条带28S/18S≥1，即达到合格。

参考文献

[1] Wilck N, Matus MG, Kearney SM, et al. Salt-responsive gut commensal modulates T H 17 axis and disease [J]. Nature, 2017, 551 (7682): 585.

[2] Ni J, Shen TCD, Chen EZ, et al. A role for bacterial urease in gut dysbiosis and Crohn’s disease [J]. Science Translational Medicine, 2017, 9 (416): eaah6888.

[3] Thompson LR, Sanders JG, McDonald D, et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity [J]. Nature, 2017, 551 (7681) : 457.

[4] Liu SJ, Shi WY, Zhao GP. China Microbiome Initiative: Opportunity and Challenges [J]. Bulletin of Chinese Academy of Sciences, 2017, 32 (3): 241-250.