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2022
04-02

干货|宏转录组全类型样本准备都在这里

肠道微生物研究方兴未艾,重磅研究成果硕果累累。这不,又有肠道菌群微生物的研究发表在Nature[1]和Science[2]上了,而地球微生物组计划的第一颗果实也在Nature[3]上发布。

继2016年5月13日美国宣布启动“国家微生物组计划”以来,微生物组研究已经成为了各国科学家及政府关注的焦点;而随后2017年12月20日重磅推出的“中国科学院微生物组计划”,再次将我国的微生物组研究推上高潮[4]。

在这样的浪潮中,我们该如何把握时机,飞得更high?奥维森基因想你所想,已为你备好微生物宏转录组宝典,专精宏转录组样本准备,助力微生物组的研究。

1宏转录组之我见

宏转录组学(Metatranomics)兴起于宏基因组(Metagenomics)之后,从整体水平上研究某一特定环境,特定时期群体生命全部基因组转录情况以及转录调控规律,揭示微生物在不同环境压力下的适应机制,探索环境与微生物之间的互作机理。其适用范围包括:人体微生态、环境、工业、农业等领域。

2常见样本类型

Metatranomics的应用非常广泛,媲美于Metagenomics,涉及各大样本类型,包括:

1. 环境微生物组,如土壤、水体、污泥、空气;

2. 肠道微生物组,如胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、粪便,小鼠肠道,反刍动物瘤胃等;

3. 工业微生物组,如传统发酵液、生物冶金或活性物质等。

然而宏转录组研究虽然火热,但是其样本准备一直是限制并提取获得高质量RNA的主要因素,为了提高其样本提取成功率,特附上宏转录组RNA样本制备方法:

1土壤样本

不同地域土壤,极低海拔或高海拔地区;

不同处理土壤,如追肥、足灌、耕作方式、污染程度等;

根系及非根系土壤,研究根际及非根际,根表及根内微生物等。

取样方法

(1)采样所用工具、塑料袋或其他物品都要事先灭菌,或用采取的土壤擦拭。

(2)取5-10 cm处普通土壤,针对际土壤,需采集20 cm深的土壤于50mL的无菌管里,多点采取重量相当的土壤进行混匀,去除杂质后再取一定量土壤装入无菌管,每个样品取样2-10g,迅速放在液氮里冻存。

(3)密封后用大体积干冰运输,且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

注意事项:为防止交叉污染,不建议使用自封袋取样。

2污泥样本

不同类型污泥,如水池、沼气池、生物电池等;

不同处理污泥,如地域、深度、污染程度等。

取样方法

(1)活性污泥样本取自活性污泥装置中,一般取样量大于20ml,将其置于无菌管中,建议立即提取后-80℃保存。

(2)海洋沉积样本根据研究目的进行取样,一般建议取1kg 以上的沉积物装入塑料袋中,低温运输并尽快进行提取-80℃保存。

注意事项:活性污泥样本等一般建议及时提取,样本体积较大,长时间-80℃保存,主要是冻融提取比较困难,加大了实验工作量及难度。建议提取后保存RNA即可。

针对固体样品可以直接冻存送样。建议使用RNA保护剂保存,具体方法如下:

(1)每克土壤加入2~2.5倍体积保护液,如1g土壤中加入2~2.5 ml保护液。注意:若对象是底泥沉积物样品,每克湿重样品请加3倍体积保护液。

(2)涡旋或手工摇匀,使样品与溶液混匀,保护液液面应当高于土样层。根据情况-20℃、4℃或室温保存。

(3)提取样本RNA时,2500×g离心5min,移除Tube管中的保护液,收集土样。

备注:常用保护液为LifeGuardTM Soil Preservation Solution或RNAprotect Bacteria Reagent。

3水体样本

不同类型,如海水、污水、养殖水等水体;

不同处理,如处理时间、深度、受污染程度等水体。

取样方法

(1)采样后进行滤膜过滤,选择合适孔径的滤膜,对于澄清水体或者略浑浊水体,选用0.22μm或者0.45 μm的滤膜,取样体积大于5L。

(2)对于浑浊水体,建议先用大孔径的滤膜过滤一遍,再用小孔径的滤膜过滤。

(3)将滤膜冻干后,用大体积干冰运输,且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

4人、动物样本

不同类型,如胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、粪便等;

不同处理,如正常与患病、不同年龄、不同药物处理时间等。

取样方法

动物组织样本,采用RNase-free水或1×PBS缓冲液(pH7.4)清洗,可用RNAlater保存剂,或液氮速冻,-80℃以下的环境中保存,或干冰运输。

所有宏转录组样本类型,提取完毕,RNA总量需大于2 μg,OD260/280值为1.6~2.3,有明显主条带28S/18S≥1,即达到合格。

参考文献

[1] Wilck N, Matus MG, Kearney SM, et al. Salt-responsive gut commensal modulates T H 17 axis and disease [J]. Nature, 2017, 551 (7682): 585.

[2] Ni J, Shen TCD, Chen EZ, et al. A role for bacterial urease in gut dysbiosis and Crohn’s disease [J]. Science Translational Medicine, 2017, 9 (416): eaah6888.

[3] Thompson LR, Sanders JG, McDonald D, et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity [J]. Nature, 2017, 551 (7681) : 457.

[4] Liu SJ, Shi WY, Zhao GP. China Microbiome Initiative: Opportunity and Challenges [J]. Bulletin of Chinese Academy of Sciences, 2017, 32 (3): 241-250.



最后编辑:
作者:萌小白
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