在上一期的内容 中，我们分享了NCBI测序数据上传的主要步骤和资料填写的注意事项。今天跟大家分享最后一步：原始测序数据的上传以及上传后项目编号的相关类型和含义。
图1 NCBI测序数据上传步骤
原始测序数据上传
完成样本属性和样本测序建库相关信息的填写后，下一步（第7步）即为测序数据上传。当然，如果测序数据量比较大，也可以在申请账号后就开始数据预上传，然后在第7步选择对应文档就可以。预上传和第7步的上传方法一样（图2、图3）。
预上传界面：
登录后 → my submissions → Options to preload data。
图2 预上传界面
图3 第7步上传界面
Aspera和FTP都是远程传递大数据量的软件。通过软件将本地地址与远程地址相连，进行文件的高速传输。
我们以Aspera浏览器、Aspera命令行、FTP 3种形式为例介绍三种上传方法，Aspera命令行看起来是代码形式，比较复杂，但其实命令很简单，上传非常快而且稳定，大文件推荐使用Aspera命令行模式。
软件安装
1. Aspera软件安装
下载地址：
https://downloads.asperasoft.com/connect2/
Tips：选择“典型安装”模式，避免无法自动弹窗显示。
2. FTP 安装
下载地址：
https://filezilla-project.org/download.php?type=client
方法一Aspera浏览器
安装成功后，进入 “步骤7”，出现弹框，询问是否启用IBM Aspera，选择“打开”（图4）；选择第一项，点击“选择文件”，弹框后，选择“允许”，选择对应文档，即进入上传界面（图5）。
图4 启用Aspera
图5 Aspera浏览器上传
Tips：如果将不同样本的序列文件压缩成一个文档，选择continue会出现warning（图6），提示找不到第6步meta data表格中的文档名，再次点击continue，NCBI会自动解压并核对文档。
图6 如有多个序列文件压缩，会提示warning界面
Tips：此步上传的序列文档名需要与metadata表格填写的filename完全一致，且文档数量也要一致。
方法二Aspera命令行模式
在预上传界面打开命令行的上传说明，或者在第7步勾选命令行选项。
1. 下载aspera.openssh，记录NCBI数据接收地址，即上传者专属路径（图7）。
图7 账户对应的专属路径和密钥界面
2. 查找记录aspera.openssh和ascp.exe两个文档的存储路径，添加两个“环境变量”：ASPERA_SCP_PASS 和Path（图8）。
图8 添加环境变量
操作如下：
我的电脑 → 鼠标右键→ 属性 → 高级系统设置 →环境变量 → 新建 →
“变量”输入“ASPERA_SCP_PASS”，“值”输入“路径/aspera.openssh”;
新建 →“变量”输入“Path”，“值”输入“路径/ascp.exe” → 确定。
3. 进入命令行模式：
Windows + R → 输入cmd → 确定 → 打开命令提示符
4. 输入命令：
（1）命令构成（各成分以空格相连）：
①"路径ascp.exe"
②-i "路径aspera.openssh"
③上传参数
④"数据存放路径"
⑤NCBI接收地址
（2）命令示例：
①"C:UsersAdministratorAppDataLocalProgramsAsperaAsperaConnectbinascp.exe"
②-i "D:aspera.openssh"
③-QT -l100m -k1 -d
④"D:raw data" ⑤[email protected]:uploads/[email protected]_JexlxJIL
Tips：-l100m，表示设定的最大上传速度。
Tips：-d表示打开本地路径，建议先将所有待上传的测序数据放在一个文件夹内，再输入命令行，即可上传该文件夹内所有文档。
如图9，输入命令后回车，界面会显示读取的文档列表、上传进度、文件大小、速度和耗时。完成后会给出Completed说明。
图9 Asper命令行上传界面（当前速度每秒约9.4M）
5. 上传完成后，回到NCBI界面，点击刷新，选择文档。
Tips：一般上传完成后，需要等待大约10min，NCBI网页才会同步上传完成。
方法三FTP上传
在预上传界面打开FTP的上传说明，或者在第7步勾选FTP选项。
1. 按图10，记录红框中的相关信息。
图10 FTP上传提示
2. 打开软件，本地站点打开对应文件夹（图11）。
图11 FTP上传文档选择
3. 建立连接（图12），输入对应主机（Address），用户名（Username），密码（Password）。
图12 与NCBI建立连接
4. 输入远程站点分配的目录位置，enter键进入上传目录（图13）。
图13 远程连接
5. 在左边的“本地站点”找到要上传的文件夹，点击鼠标右键，点“上传”，页面下边则会有文件在上传的队列中。上传完成后，回到NCBI界面刷新。
Overview 总览
上传完成后可检查所有信息，确认无误后提交。
跳转至my submission，显示已提交，等待处理。大约10分钟后，Bioproject和Biosample一般会先处理完成，然后SRA待处理（图14）。1-2天后，SRA处理完成，即可获得样本和项目的SRA编号。
图14 上传进程查看
由于整个过程涉及到的编号非常多，所以我们进行了对比汇总，其中红色编号表示可以用在文章中作为检索测序数据的编号（图15）。
图15 NCBI上传编号说明
以上就是原始测序数据上传至NCBI的SRA数据库的所有操作指南，希望能帮助大家在数据上传时少走一些坑，让数据上传之路畅通无阻~
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