CRISPR/Cas9是一项可对基因组特定靶基因进行编辑的DNA操控技术，该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成，Cas9蛋白在sgRNA的引导下对靶位点处的DNA双链进行剪切，并产生一个平末端的双链DNA缺口，进而启动DNA损伤修复机制，通过非同源末端链接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组(Homologous recombination，HR）的方式将断裂上下游两端的序列连接起来。
目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术在疾病基础研究、靶点验证、药物分子的高通量筛选、以及遗传性疾病的治疗等领域得到了越来越广泛的应用。sgRNA在CRISPR/Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等，甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此，设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。
sgRNA的设计流程
sgRNA的设计原则
1. sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt。
2. sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)，所以选择3'末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%（40%-60%）。
3. sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。
4. 如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。
5. 全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个。
6. 如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上。
sgRNA设计示范
此处以查询人类WNT10B基因为例。在NCBI Gene数据库中输入需要查找的人类WNT10B基因，查找的结果显示多个与WNT10B相关的基因，这些基因包括了不同物种的WNT10B同源基因。因而查找时需要注意该基因在NCBI的登录号与种属描述等。点击查询人类WNT10B基因，显示出该基因的基本信息（图1）。
(图1) NCBI网站查询WNT10B基因信息
找到该基因的mRNA and Protein(s) 相关信息，查询可知WNT10B的mRNA 编号为 NM 003394.4。如果该基因可以通过可变剪接产生多个mRNA亚型的话，在下图中会依次记录（图2）。
（图2）NCBI网站查询WNT10B基因mRNA信息
使用SnapGene软件对基因序列信息进行分析，如下图所示,WNT10B基因一共包含4个外显子，其中粉色区域为信号肽所在序列，该序列在蛋白质翻译加工过程中会被切除，sgRNA设计时应避免此段序列，最左边的的外显子序列也不参与蛋白质的翻译，也应该避免采用此段序列，所以最佳的sgRNA靶向序列应采用图中蓝色选定区域（图3）。
（图3）WNT10B基因结构组成图示
选取上图中序列作为sgRNA的靶序列，在sgRNA设计网站输入靶基因信息和设计相关信息。
现在有多种sgRNA设计网站可供选用，常用的设计网站包括：
1. CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）
2. GPP Web Portal （https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public/）
3. E-CRISP （http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）
4. CHOPCHOP （http://chopchop.cbu.uib.no/）
此处我们选择张锋实验的CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）来进行sgRNA的设计，输入上文选择的靶序列，选定基因对应的物种信息和想要使用的Cas9和PAM种类后点击提交（图4）。
（图4）sgRNA设计网站界面
网站生成的sgRNA序列和相关信息如下图所示，信息包括sgRNA的位置，网站给出的特异性评分，切割效率评分，潜在的脱靶结果和脱靶位点相关信息（图5）。
（图5）网站生成的sgRNA方案和分析
sgRNA脱靶分析
网站会生成多个备选sgRNA结果，我们需要根据信息筛选出最佳的sgRNA，上图中根据生成的sgRNA信息，我们可以从特异性评分，剪切效率评分，潜在脱靶情况和脱靶位点信息几个方面进行分析，选取最佳sgRNA。上图中第一个和第五第六个sgRNA被标注为 inefficient，所以我们可以优先考虑第二第三和第四个sgRNA作为备选方案。
除了该网站自带的脱靶信息分析以外，根据选择的sgRNA，我们也可以通过脱靶分析网站对sgRNA进行脱靶分析。
推荐使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在线网页进行预测。将sgRNA序列输入，选定相应种属基因组进行分析。并且对获得的遗传材料进行检测。挑选前10个潜在脱靶位点，通过PCR测序验证是否脱靶。如果实验要求较为严格的，则需要通过全基因组测序鉴定脱靶情况（图6）。
（图6）脱靶分析网站
输入sgRNA+NGG序列和对应信息后，点击提交，得到如下结果图
图7 脱靶分析结果
根据图中信息即可分析sgRNA的剪切效率，潜在脱靶位点信息等（图 7）。
除上文提到的脱靶效应分析网站外，之前提到的E-CRISP和CHOPCHOP这两个sgRNA设计网站也包含脱靶分析功能。
sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等，甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此，设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。sgRNA包括20nt的靶向序列，crRNA，linker loop 和 tracrRNA几个部分共同组成（图1）。通常我们所说的sgRNA设计指的就是针对20nt的靶向序列进行设计，而选择合适的靶向序列就是sgRNA设计的核心工作。
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