FFPE样本制备及分析——DNA样品质控&实用研究| 实验技术专题

DNA样品质控

尽管最佳的裂解和孵育条件可从FFPE样品中释放DNA，部分逆转甲醛修饰，但对于纯化后DNA的下游分析，仍有一些限制。首先，固定过程中的化学修饰可能引入不想要的序列变化，降低DNA稳定性和酶学分析的效率，让A260/A280的纯度分析变得困难。其次，由于FFPE样品中的DNA随时间而逐渐片段化，故只能分析短序列（例如在PCR应用中，应当设计产生短扩增子的引物）。此外，较短的DNA片段可能导致DNA产量的过高估计，因吸光值读数更高。所以对于FFPE样本需要进一步质控，才能进行后续实验及分析。

市面上有Swift 和KAPA公司使用不同长度的引物来扩增大量存在于人类基因组中的序列，根据qPCR产物比值来评估样本质量， Alu247/Alu115：Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族的一员，约有50万份拷贝。平均4～6 kb中就有一个Alu序列，是中度重复序列DNA。由于这种DNA序列中有限制性内切核酸酶AluⅠ的识别序列AGCT，所以称为Alu重复序列。通过长 (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 扩增子比值可评估gDNA的完整度。

Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR扩增产物浓度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分别指129bp和41bp产物、305bp和41bp产物浓度比值。以及Agilent公司DIN：即 DNA Integrity Number，是指DNA经安捷伦生物分析系统 2100/4200 TapeStation分析并计算的出的数值，是对DNA完整性的评分（表1）

表1不同厂商DNA质控标准

使用了DIN值和Q129/Q41来对不同FFPE样本DNA进行质量检测，结果显示DIN值和Q129/Q41具有很好的相关性，均能很好的衡量DNA的质量。

图不同质控参数对FFPE样本(Blocks 1–5)的DNA质量评估显示DIN值和Q129/Q41具有很好的相关性

实验结果表明Q score>0.4或者DIN>3.5时，样本DNA即可对目标区域进行更有效的覆盖，此时文库丰度较好，可获得可靠的测序数据。

图最大平均测序深度与Q score和DIN值的关系

随着FFPE样本DNA的Q score值和DIN值提高，最大平均测序深度（Max mean coverage）也相应线性提高。

实用研究

1.FFPE样本的储存时间和其DNA质量、文库构建质量以及WES检测关系

Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue

文中选用的是高度恶性的卵巢浆液性腺癌（high-grade serous ovarian adenocarcinomas）FFPE样本，对FFPE样本的储存时间和其DNA质量、文库构建质量以及WES检测结果进行评估。

首先从3个样本中各选取了20个FFPE样本（组织学、形态学符合要求，切片中50%以上为恶性肿瘤细胞，50%以下为坏死细胞），其中一个样本因存储时间不详去掉。这些样品按照存储时间分为3组（3-12年、13-22年、23-32年）。每张切片取不同位置的组织样品进行DNA提取，剩余的59个样本中有一个FFPE样本因提取出来的DNA含量极低而舍弃，最后共计对58个样品进行了外显子测序（WES），成功测序53个。