13分纯生信分析全流程解析！学会成为组会上最靓的仔！

解读生信之美，探索每篇文章背后的故事

大家好呀，我是风间琉璃。前面我们学习了这么多转录因子相关的顶级文献操作（“17+干湿结合转录因子生信套路！新的技能点又增加了！国庆回来给老板汇报用！”、“真香预警！近30分多组学干湿结合套路，你看这些图是不是很熟悉，仿佛自己也能来一套的样子？！”、“中科院一区近30分SCI，给你演示下干湿结合顶级套路！学会这个模板，收获一波10+代表作！”），想必大家已经对ChIP-seq和ATAC-seq技术已经不陌生了。

ChIP-seq可能同学们在做实验的时候已经接触到其对应的实验技术ChIP了，那么ATAC-seq具体原理是什么，分析流程是什么呢？今天我们就来学习既往研究者针对ATAC-seq分析流程所发表的综述“From reads to insight: a hitchhiker’s guide to ATAC-seq data analysis”，于2020年发表在《Genome Biology》杂志上。好，废话不多说，我们直接开始解读吧~

虽然前面提到了也要列在这里的传送门

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〇、期刊信息

一、研究背景

ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)于2013年首先开始应用以来，呈指数性增长趋势（Figure 1a）。应用程度比其他DNA开放区域检测技术相比更加普及。由于Tn5转座酶的高反应性，只需要500-5000个细胞就可以进行分析。并且灵敏度和特异度和DNase-seq相当，由于FAIRE-seq，但后两者技术对细胞数的要求更加苛刻。由于ATAC-seq并不需要非常严格的建库标准，所ATAC-seq也能够通过片段的长度识别核小体的位置。并且随着FACS、微流体技术的发展，对于单细胞的scATAC0seq也得到开展，并对揭示临床样本以及发展生物学的细胞异质性具有重要作用。比如正在检测正常造血以及白血病之间染色质可及性的变化。

（Figure 1a）

作者根据ATAC-seq数据分为四个步骤：

1.预处理（质控和比对）；

2.核心分析（peak鉴定）；

3.高级分析（peak注释、motif分析、核小体分析、TF足迹）；

4.多组学整合分析（Figure 2）。

二、预处理（质控和匹配）

这一步包括3个小步骤：（1）比对前QC；（2）read比对；（3）比对后质控和处理。

1.质控：首先比对前需要通过FastQC展示碱基的质量，接下来通过trimmomatic进行去除已知的adapter序列。

2.比对：使用BWA-MEM或者Bowtie2对于短的双端reads进行比对，成功率达到80%以上则认为是比较成功的。对于哺乳类动物，建议最少在开放染色质的区域为5000万个reads，并且至少有200百万TF的足迹。

3.比对后质控：得到比对后的BAM文件后，在线粒体以及ENCODE上的blacklist区域的片段需要被移除（具有极高的read覆盖率），另外因为PCR导致的高重复率同样需要排除。

另外ATAC-seq特有的质控标准同样需要评估，比如片段大小分布图（fragment size distribution）需要梯度式下降，分别是无核小体区（<100bp）、单核小体（200bp）、双核小体（400bp）、三核小体区域（600bp）（Figure 1b）。

（Figure 1b）

来自于无核小体区域的片段通常在转录起始位点（TSS）区域明显富集，而核小体结合的区域则是在TSS位置信号是缺失的，但是在两侧明显富集（Figure 1C）。这些可以通过ATACseqQC进行评估。

（Figure 1C）

所以标准化的标准流程是：FastQC➔ trimmomatic➔BWA-MEM➔ATACseqQC。

三、Peak鉴定（核心分析）

Peak鉴定在我们前面的推文中也提到过，主要是对peak所映射的染色体位置信息以及对应的基因。类似于Chip-seq或者DNase-seq，ATAC-seq也推荐使用MACS2进行peak call。但是于Chip-seq不同的是，ATAC-seq不需要input作为control组进行对照。并且同时对无核小体区域片段以及核小体结合片段进行peak鉴定（Figure 3A）。并进一步通过平移延伸（shift-extend）的方式来对无核小体区域的peak进行平滑处理（Figure 3B）。

（Figure 3A,B）

目前流行的peak caller主要分为两大类：

1.基于count

2.基于shape 的peak caller。

前者包括MACS2、HOMER等，后者包括PICS、PolyaPeak等。

ATAC-seq主要适用于前者（Figure 4）。其中ATAC专属的HMMRATAC计算效果比MACS2和F-seq效果都要好，并提供了额外的核小体位置信息。

（PS:这里作者推荐一般来说使用MACS2和HOMER进行peak calling。如果计算资源充足，则可以考虑HMMRATAC）

四、ATAc-seq高级分析

peak相关高级分析

peak的差异分析

现目前并没有专门为ATAC-seq涉及的差异peak分析工具，目前的差异分析工具根据分析方法同样分为两类，分别是1.consensus peak和2.sliding window-based。对于前者包括HOMER、DBChip、DiffBind依赖于RNA-seq差异分析所需要的包，比如edgeR、DEseq2所作的分析。其中DiffBind或者DBChIP具有交集或者union的选项。后者包括ChIPDiff、PePr等等（Figure 4）。

（Figure 4）

peak注释

获取到peak的集合之后，注释peak可以使用HOMER、ChIPseeker、ChIPpeakAnno等工具。这些工具能够将peak映射到最近的基因以及对应的基因区域，并且可以通过饼图的方式展示注释的基因特征（Figure 1D），除此之外还可以进行GO、KEGG等功能注释。

motifs分析

虽然ATAC-seq能够对peak进行注释以及相关的功能富集分析，但是并不能对潜在机制进行解读。而motif则是TF和DNA结合的特定序列，TF所结合的特定位点则是TFBS(TF binding site)。大部分TF结合在染色质开放区域，但是少数的pioneer TF则能够结合到并不完全开放的区域。而转录因子结合的位点能够导致片段在这一区域富集水平相对下调，从而形成TF足迹（footprint）。人类大概有1600多个TF，其中超过一半通过实验和计算获得对应的motif。TF通过和组蛋白以及非组蛋白竞争结合到DNA上发挥转录调控作用。目前有两种对于motif分析的方法：1.基于序列的预测进行motif的频率以及活性预测；2.footprint去计算TF的占有率。

motif数据库以及筛选

目前普遍使用的数据库包括JASPAR等数据库，motif以文本的格式保存为PWM的形式。HOMER以及R包TFBSTools、motifmatchr能够通过PWM给定的核苷酸序列搜索对于潜在的TF结合位点。而MEME和PWMScan由于它的网络交互页面所以具有更好的使用体验。

motif的富集和活性分析

通过前面的motif搜索工具，每个peak区域的motif的位置和频率信息就有了，接下来可以通过HOMER或者MEME-AME进一步计算TF的出现频次和活性，并和背景信号进行比较，从而推测转录因子的活性。除此之外，还包括ChromVAR能够计算每个motif在多个分组中的可及性，并用Z score的方式进行评分（这是专门为scATAC-seq数据设计的分析）。

TF足迹（footprint）分析

另一个评估TF调控的方式则是footprint。Footprint是因为TF结合在DNA上阻碍了Tn5酶的剪切，从而留下了开放染色质区域种的一个相对缺失（波谷）。但是目前对ATAC-seq的分析是存在障碍的：（1）首先在预处理的时候需要移动原始read，由于具有 9个碱基的重复；（2）由于Tn5的亲和力很强，并且TF短暂结合具有较弱的结合能力。所以footprint并不容易检测。因此footprint检测并不准确。

目前分析footprint的工具包含两类：（1）de novo以及（2）motif-centric方法（Table 1）。前者基于footprint的特点模式（peak-dip-peak）进行预测，接下来则通过推定的footprint位点与已知的motif进行联系或者是验证发现新的motif。后者则是基于先验的TFBS并且通过监督以及无监督的方式区别这些位点是否是结合的。De novo tools方法包括HINT-ATAC校正了链特异性的Tn5剪切偏倚。Motif-centric tools这类方法作者推荐BaGFoot工具，能够计算footprint depth并且对测序深度以及偏倚进行校正。总地来说作者推荐HINT-ATAC工具。

核小体位置分析

核小体由组蛋白形成的八聚体以及147bp的DNA构成。在ATAC-seq分析种，更长的DNA片段通常是由于核小体相关的区域导致的。但是检测出核小体的覆盖率要低于MNase-seq。HMMRATAC and NucleoATAC是两个最常用的ATAC-seq核小体检测的方法。

五、多组学数据整合分析构建调控网络

ChIP-seq数据整合

由于开放染色质同上是TF结合的前提，所以ATAC-seq peak通常与TF的ChIP-seq进行重叠，但是前者的范围更广。所以两者可以相互验证。只在TF的ChIP-seq中存在的peak才可以视作为pioneer TF结合到关闭的染色质范围上。对于ATAC-seq的motif和TF足迹分析能够进一步整合到真实的TF的ChIP-seq中，从而降低假阳性率。同样ATAC-seq能够和组蛋白的ChIP-seq进行分析，并找到组蛋白对于染色质的开放促进还是抑制作用（与开放区域转录正相关，如H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac等，以及与开放区域转录负相关，如H3K27me3）

RNA-seq整合

差异基因同能能够逆向推定上游的TF，并找到在开放染色质特定的footprint和motif。通常是scATAC-seq和scRNA-seq的联合。

构建regulatory网络

这里最常使用在scATAC-seq分析，比如Cicero包进行的STAC-se增强子-基因调控网络(Figue. 3C)。

好啦，关于ATAC-seq的综述就讲解到这里啦，我是风间琉璃，我们下期见~