超实用！微生物重测序分析软件——bwa的使用

微生物重测序是基于高通量测序数据，与近缘参考基因组进行比对，进行变异检测的方法。通过重测序可以获得目标基因组对于参考基因组的SNP、InDel、SV等一系列变异信息，从中尝试对基因组之间的性状差异进行解析，或作为标记进行大规模的进化分析。本期小编将以微生物重测序分析为例给大家介绍短序列比对软件bwa的使用。

一

BWA 下载安装

下载https://nchc.dl.sourceforge.net/project/bio-bwa/bwa-0.7.15.tar.bz2

tar -jxvf bwa-0.7.15.tar.bz2# 解压缩

cd bwa-0.7.15

make # 编译

配置环境变量：

若要临时修改环境变量，可直接在终端输入下面一行命令：

Export PATH=/where/to/install/bin:$PATH
要永久修改环境变量可将下面第一行添加到~/.bash_profile(针对当前用户)或者/etc/profile(针对所有用户)文件的末尾，再执行第二行命令即可：

Export PATH=$PATH: /where/to/install/bin；

source ~/.bash_profile或者source /etc/profile

现在bwa已经安装好了，下面我们就利用bwa对微生物reads进行mapping

二

使用流程

1.输入文件：我们以两个肠杆科菌株数据为例(sample1和sample2)，两个菌株的测序仪下机数据fastq格式数据，和E.coli的MG1655参考基因组序列ref.fa;

Fastq文件每四行表示一个read（如上图所示），其中第一第三行表示read名称等相关信息，第二行为read序列，第四行为第二行对应的每个碱基质量值。

参考基因组文件: NCBI下载的E.coli MG1655基因组序列ref.fa和基因组注释文件ref.gff(用于变异注释)

2. bwa mapping到参考基因组

1）为参考基因组建立索引

bwa index ref.fa #参数说明：

-a BWT构建算法：bwtsw, is of rb2 [default]，bwtsw适用于较长基因组，另外两个使用于短基因组;

-p 索引的前缀[same as fasta name]；

-b bwtsw算法模块长度，与-a bwtsw一起使用，[default 10000000];

2）寻找SA coordinates

bwa aln ref.fa sample.fq1.gz > sample.fq1.sai # pair-end

bwa aln ref.fa sample.fq2.gz > sample.fq2.sai

bwa sample ref.fa sample.fq1.sai sample.fq2.sai sample.fq1.gz sample.fq2.gz > sample.sam

bwa aln ref.fa sample.fq.gz > sample.fq.sai # single-end

bwa samse ref.fa sample.fq.sai sample.fq.gz > sample.sam

sam文件格式如下，以@开头的行为注释行，没有@开头的部分为具体比对信息，每行表示一条read与参考基因组的比对情况，每行共有12列，依次为：read name，flag,参考序列编号，比对上的位置，mapping的质量值，简要比对信息表达式，下一个片段比对上的参考序列编号，下一片段比对到参考序列上的第一个碱基位置，参考序列和比对上的序列共同组成的序列Template的长度，序列片段信息，序列质量值信息以及可选区域（格式为TAG TYPE VALUE）。

3）将sam进行排序，并转换为bam文件

samtools sort sample.sam –output-fmt BAM –o sample.sort.bam

参数说明：

--output –fmt BAM 指定输出文件为bam格式文件；

-o 输出文件名；

统计所有位点的测序深度

samtools depth –a sample.sort.bam > sample.depth

参数说明：

-a 输出所有位点，包括深度为0的位点；

-l read长度阈值，低于该长度的read将被忽略；

-d 最大覆盖深度，默认8000；

-q 碱基质量阈值；

-Q 比对质量阈值；

Sample.depth 文件(如下图所示)由三列组成，依次为染色体名，参考基因组位点，和该位点的覆盖深度。

Samtools 软件的安装和使用将在下期进行详细介绍。

三

参考文献

Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.[J]. Bioinformatics, 2010, 25(14):1754-1760. doi: 10.1093/bioinformatics/btp324, pubmed:19451168.

Ayat H, Doruk B, Toland A E, et al. Benchmarking short sequence mapping tools[J]. Bmc Bioinformatics, 2013, 14(1):184