转录组测序——RPKM、FPKM、TPM

在转录组测序（RNA-Seq）中，对基因或转录本的read counts数目进行标准化（normalization）是一个极其重要的步骤，因为落在一个基因区域内的read counts数目取决于基因长度和测序深度。

基因长度的影响：在同一个样本中，基因越长，随机打断得到的片段就越多，该基因被测到的概率就越大，比对到该基因的reads就越多。

测序深度的影响：不同样本中，样本的测序深度越高，同一基因被测到的次数越多，比对到该基因的reads就越多。

RNA-seq是通过NGS技术来检测基因表达量的测序方法，在衡量基因表达量方面，若是单纯以比对到参考基因的Reads个数（我们通常称之为Count值）来衡量基因的表达量，在统计上是一件相当不合理的事，所以需要一种方法进以横向比较。今天就为各位介绍一下基因表达量的衡量指标：RPKM、FPKM、TPM。

RPKM：Reads Per Kilobase Million，代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。RPKM是将map到基因的read数除以map到基因组上的所有read数(以million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)，RNA-seq中用来表示基因表达量或丰度的方法。

total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads

mapped reads (Millions) ：某个样本的所有reads总和

exon length(KB)：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以KB为单位）

FPKM：Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)，FPKM与RPKM计算方法基本一致。

FPKM和RPKM的原理是相似的，区别在于FPKM对应的是DNA片段(fragments)，而RPKM计算的是数据(reads)，Fragment比read的含义更广，因此FPKM包含的意义也更广。比如在一个Illumina的pair-end（双尾）RNA-seq中，一对（两个）reads对应是一个DNA片段。

有了FPKM（RPKM）概念，我们就能比较：同一个样本中基因A和基因B的相对表达量；或者不同样本中，同一个基因的相对表达量。RNA-Seq的基因表达值通常用RPKM或者FPKM表示。现今TPM变得越来越流行。

TPM：Trans Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Trans)

Ni：比对到第i个exon的reads数

Li：第i个exon的长度

sum(N1/L1+N2/L2 + ... + Nn/Ln)：所有 (n个)exon按长度进行标准化之后数值的和

TPM其实跟RPKM，FPKM也很相似。TPM唯一不同的地方就是计算次序不一样。所以，当计算TPM的时候，先对基因长度进行归一化，其次是测序深度的归一化。然而，归一化次序不一样，对结果影响差别就很大。当使用TPM时候，每个样本的TPM总和是一样的。这使得比较同一个基因的reads数在不同样本间的比例变得容易。FPKM和RPKM与此相反，每个样本的FPKM或RPKM的累加和可以不一样，造成样本间不能直接比较FPKM或RPKM值。

除了RPKM、FPKM、TPM之外还有许多算法，比如TMM、DESequ等，这里面就不逐一为各位介绍了，如果感兴趣可自行查询~