Addgene质粒的穿刺菌制备、保存及单克隆复苏详细指南

引言

在分子生物学和遗传学研究中，质粒作为一种常用的工具，扮演着至关重要的角色，它们不仅作为基因克隆和表达的载体，还是众多生物技术应用的核心。Addgene作为一个国际性的非营利性质粒库，通过高效且准确的质粒分享系统，极大地促进了全球科研合作与进步。本文旨在详细介绍Addgene提供的穿刺菌形式质粒的接收、保存及复苏流程，强调了从穿刺菌到单克隆菌落培养的重要性，以及这一系列精细操作背后的科学原理和实践技巧。

穿刺菌的制备

Addgene质粒以穿刺菌的形式运输。Addgene的技术人员会在装有甘油菌的小管上打上二维的条形码，每个穿刺菌对应一个单独条形码，以保证质粒被正确运输。Addgene技术人员用无菌牙签取一些库存细菌，然后接种形成穿刺菌。穿刺接种的细菌在温箱中孵育过夜（每个质粒的生长温度信息可以在Addgene官网上查询），并在第二天上午检查其是否生长，技术员应该在制备的穿刺菌表面上能看到细菌。条形码在包装时要再次扫描以确保科学家收到正确的质粒样品。

图1、Addgene穿刺菌

Addgene质粒培养方法

您收到穿刺菌后，应该在4摄氏度冰箱中存放您的质粒样品。并在两周内，在含有相应抗生素（每个质粒的抗生素信息可以在Addgene官网上查询）的琼脂平板上划线培养出单菌落。然后从一个单菌落中挑取细菌，接种到液体培养基中，依据Addgene网站上质粒的生长条件进行过夜培养。

保存细菌时，需要将300ul细菌的液体培养物和300ul 50%的甘油按照1:1比例混合制成甘油菌，储存在-80摄氏度冰箱中。甘油菌通常是长期存储质粒的一个好方法。此外，您可以使用细菌培养物提取质粒以备以后使用或存放。

为什么一定要挑取单克隆？

当从甘油保存的细菌或者穿刺菌中复苏细菌时，从琼脂板上挑取单菌落再液体培养显得尤为重要。由于甘油菌或穿刺菌中的大多数细菌细胞在遗传上应该是相同的，但是偶然情况下，会存在个别隐藏的突变细菌。如果你只是简单的从混合菌落中挑选了一团细菌，然后在液体培养基中培养，那么突变的细菌就有可能会接管整个培养物，从而影响您的实验。我们可以通过划线挑选单个菌落的方式来解决问题。在这种情况下，每个单独的菌落就是单克隆，即它们在遗传学上是相同的。使用这些单克隆菌落形成的液体培养物，将会获得预期的质粒产率并在后期试验中获得更一致的结果。

划线前需要准备的材料

在正式开始培养前，我们需要收集一些必要的材料。

1、首先是含有你感兴趣质粒的甘油菌或穿刺菌；

2、其次是含有合适抗生素的LB琼脂平板；

3、无菌的牙签或者无菌的接种环；

4、酒精灯或其他火焰；

5、30或37摄氏度的干燥培养箱；

6、最后是良好的无菌操作技术。

图2、划线前需要准备的材料

划线培养方法

首先，我们取出含有适当抗生素的LB琼脂平板，确保平板上没有污染并且干燥。如果平板上有水珠，你可以把它打开然后放在火焰下约10分钟来风干。接下来，我们要看一下我们的穿刺菌，确保其中有可见的细菌生长。然后取一个无菌的牙签，把它插入并接触到有细菌生长的穿刺区域，这个过程也可以是将无菌的牙签浸入到半融化的甘油菌当中。请注意的是，在牙签上你不需要看到肉眼可见的一团细菌，看起来很干净的牙签表面可能已经被细菌充分覆盖了。

用牙签轻轻地从平板的边缘附近开始划线，牙签与平板接触角度大概在45度左右。请注意一定要轻轻的划线，不要用牙签刺破平板，否则你就会在划线过程中将琼脂翘起来。在划线时要遵循一定的路径，并且需在每个新路径开始时用一根新的无菌牙签。用第一根牙签划线时，我们需要轻轻地连续划线大约至1/3平板大小，并注意避免碰到平板的边缘。扔掉第一根牙签，并转动平板，然后使用一根新无菌牙签从上一次结束的地方开始连续划线约 1/3区域，并在靠近边缘的地方结束。最后，我们用第三根牙签再重复一次这一过程。尽管，这个过程会很快，我们仍需要很细心。

需要确保在培养之前平板是完全干燥的。这是由于，如果细菌在平板上是一层液体的话，它们有可能会在平板上扩散并形成一层菌群而不是单个的菌落。需要注意的是，要将平板倒置放入培养箱中，以避免冷凝的液体会滴到菌落上而干扰它们的生长。现在我们已经完成了划线，我们将平板倒置放入培养箱中过夜或者至少培养12小时。你可以看到我们精心划线后会有单个菌落出现，之后就可以挑取单个菌落以便用于下游各种各样的实验。

图3、穿刺菌培养方法示意