Microorganisms：比较基因组和生理分析揭示某细菌是人类肠道微生物群非典型脱氧胆酸的产生者

作者：微生态

编译：微科盟中元，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

人类肠道中有胆汁酸7α-去羟基细菌，通过bai操纵子编码的酶从宿主来源的胆汁酸中产生次级胆汁酸，如脱氧胆酸(DCA)。虽然最近的宏基因组研究表明，这些细菌是高度多样化和丰富的，但DCA生产者很少被确认。本文研究了20世纪80年代从人类粪便中分离的DCA产生菌Eubacterium sp. c-25的生理特性，并测定了其全基因组序列。培养实验表明，DCA的生长和生产均偏向于中性和偏碱性。基因组分析表明，c-25在系统发育上与已知的DCA产生者不同，其预测胆汁酸诱导(bai)基因的多簇排列与典型的胆汁酸诱导(bai)操纵子结构有很大不同。这种排列在其他肠道细菌物种中也发现，可能表明7α-去羟基化的能力尚未证实。在胆酸底物存在下，诱导baiB、baiCD和baiH的表达支持了预测bai基因的功能。总之，Eubacterium sp. c-25是一种非典型DCA产生菌，它具有一种新的bai基因簇结构，可能代表了人类肠道中DCA产生者未被探索的基因型。

论文ID

原名：Comparative Genomic and Physiological Analysis against Clostridium scindens Reveals Eubacterium sp. c-25 as an Atypical Deoxycholic Acid Producer of the Human Gut Microbiota

译名：对梭状芽胞杆菌的比较基因组和生理分析揭示Eubacterium sp. c-25是人类肠道微生物群非典型脱氧胆酸的产生者

期刊：Microorganisms

IF：4.128

发表时间：2021.10.29

通讯作者：Satoru Fukiya

通讯作者单位：日本北海道大学

DOI号：10.3390/microorganisms9112254

实验设计

结果

1 形态学

从6 h c-25培养物中，收获对应于指数生长阶段的细胞用于扫描电镜观察。在以前的一份报告中，观察到c-25以单一的杆菌状细胞或2-3个细胞短链的形式存在。然而，我们观察到c-25细胞形成长的、端点与端点相连接、无分支的细丝的单细胞形态，这种形态极其罕见(图2)。由于这些结构特征，细胞边界有时难以划定。大多数节段长度为1-2 μm，少数异常段可达8 μm。

几乎每个细胞都有横向排列的表面结构，通常形成环状图案(图2a，箭头)。鞭毛和纤毛不可见。在一些细胞链的末端也发现了大的、大致呈球形的结构(图2c，箭头)。

在12小时(图2c)和24小时(未显示)分别对应于指数后期和生长平稳期的时间点观察到的细胞c-25形态无明显差异。

图2 Eubacterium sp. c-25的扫描电镜图。形态学观察状态：(a)单细胞，(b,c)丝状的，(d)缠结丝状。可见细胞外结构为白色箭头所示。图中显示的图像是生长6小时(a,b,d)或12小时(c)后拍摄的。

2 生长和胆汁酸产量

通过一系列培养实验，比较了Eubacterium sp. c-25与C. scindens菌株G10和ATCC 35704T的生长和DCA产量。值得关注的一点是c-25在不同pH条件下生长和产生DCA的能力，因为研究表明胃肠道pH沿肠道长度高度变化，并受到各种生理因素的影响。根据当地环境的理化性质，不同胃肠道区域微生物群落的组成是不同的。此外，早期使用洗净的全细胞进行的研究发现，c-25和C. scindens菌株VPI 12708的7α-去羟基化酶活性的最佳pH值分别为7.3-7.7和7.0，这为研究pH值对体外培养代谢活性DCA产生的影响提供了依据。为此，将培养基pH调整为初始pH 6,7,8或9(±0.15)，并使用pH为7的预培养物进行接种。在48小时内测量了生长和胆汁酸产量。培养基没有进行缓冲，因为初步数据显示，当存在几种经测试的有机缓冲液时，c-25的生长明显下降(数据未显示)。因此，培养基pH值的调节导致了短暂的初始pH值，由于二氧化碳和酸性细菌代谢物共同形成碳酸，初始pH值随着时间的推移缓慢下降。测定每种培养基的初始和最终培养基pH值，见表S3。在每个样本中分析的胆汁酸是CA、DCA和7-oxo-DCA，因为这是在含CA的c-25培养物对31种胆汁酸进行初始胆汁酸筛选时检测到的唯一胆汁酸(数据未显示)。7-oxo-DCA由CA通过7α-羟基甾体脱氢酶催化的可逆反应生成。因此，CA、DCA和7-oxo-DCA被解释为与CA代谢相关的总胆汁酸定量相关池。据报道，已知的DCA生产者具有不同程度的7α-去羟基化能力，其中C. scindens表现出特别高的活性，比其他菌株高出约100倍。我们的测试结果似乎与这些报道一致(图3a-h)。在pH值为7和8时，G10和ATCC 35704T的DCA增加最快，CA下降最快。在这两种pH条件下，CA的相对水平在2-6 h内迅速下降，符合指数前期到指数中期的生长阶段。这种下降伴随着DCA的相应增加，DCA在胆汁酸池的80-90%处趋于稳定。在DCA初始峰值后，7-oxo-DCA在胆汁液池中保持恒定的5-10%。虽然在pH为6和9的条件下也能观察到生长和DCA的形成，但生长速率较低，CA到DCA的转换延迟。有趣的是，G10在pH值为9时比pH值为6时更有利于DCA的形成，而ATCC 35704T则相反。DCA的形成与细胞密度并非必然相关，pH值为6的两株C. scindens菌株在生长早期低OD660条件下均表现出相当高的DCA形成。总的来说，DCA和7-oxo-DCA的检测，以及CA的几乎完全去除，证实了两株菌株的7α-去羟基化和7α-羟类固醇脱氢酶活性的变化。在所有条件下，c-25培养物的OD660均显著降低，其峰值为0.374，而G10和ATCC 35704T的OD660分别为1.310和1.133(图3i-l)。菌株在pH值8时生长最快，OD660峰值最高。在pH值为7和8的条件下，48 h内c-25胆汁酸产量显示CA含量稳定下降，DCA和7-oxo-DCA含量相应增加。然而，转化率远远低于C. scindens菌株，约36 h 70-80%的CA底物代谢。在pH值为8的条件下，DCA生成量最高，在36到48 h的孵育后，DCA的水平继续增加近50%。值得注意的是，在pH值为7和8时，总胆汁酸池中7-oxo-DCA的比例也远远高于C. scindens菌株。这在pH值为7时尤其明显，7-oxo-DCA水平超过36 h的DCA。有趣的是，在pH值为6时，没有生长或CA转换的迹象。在pH为9时，虽然培养物显示出明显的生长，但没有观察到DCA的产生，唯一的证据是12小时后胆汁酸转化为7-oxo-DCA。在最适生长条件方面，C. scindens ATCC 35704T、C. scindens G10和Eubacterium sp. C. 25更倾向于中性条件，而不是弱碱性条件，即pH值为7和8。这些也是诱导DCA快速产生的条件。然而，DCA的产生者对7α-去羟基CA的能力似乎与其生长和增殖能力是分开的。在pH值为6和9的G10和ATCC 35704T培养液中(图3a,d,e,h)，细胞密度和DCA的产生并不直接相关，可能是由于酶活性的差异或诱导的bai基因表达。这在c-25中尤其明显，在pH值为8时DCA的形成高于pH值为7时，但在pH值为9时没有检测到DCA，尽管观察到适度的生长(图3j-l)。

图3 不同初始pH条件下，包括Eubacterium sp. c-25在内的DCA生产者的生长和胆汁酸产量的时间过程分析。试验菌株为：(a-d) C. scindens ATCC 35704T， (e-h) C. scindens G10和(i-l) Eubacterium sp. c-25。生长用OD660(虚线)测定。胆汁酸的百分比是由胆汁酸的浓度相对于CA(黑色方块)、DCA(红色圆圈)和7-oxo-DCA(蓝色三角形)的总浓度来计算的。给出了三个独立实验的平均值。

3 全基因组测序和菌株鉴定

为了在利用基因组序列信息进行系统发育分析的基础上对c-25进行分类鉴定，我们与C. scindens G10一起确定了c-25的全基因组序列，该全基因组序列也缺乏基因组信息，可用于与c-25的基因组比较分析(表2)。利用新获得的基因组数据，对c-25 16S rDNA序列进行BLASTn搜索，以寻找近缘物种。有趣的是，最接近的匹配是Lachnoclostridium phocaeense，一种从人类尿液中分离出来的细菌，其序列一致性为97.2%。虽然这已经低于建议的物种划分阈值~ 98-99%，但我们还进行了ANI分析，更确定地区分c-25和L. phocaeense(图4)。结果显示，c-25的ANI值只有74.9%，远低于普遍接受的95%种内截断值，我们认为c-25与L. phocaeense不是同一种。此外，与表1所列的其他DCA生产者相比，观察到更低的ANI值(64.65%至71.82%)，表明至少在物种水平上，c-25在它们之间的系统发育唯一性。C. scindens G10也表现出与其他DCA菌株相似的ANI值(64.66% ~ 73.75%)，但与C. scindens ATCC 35704T的匹配度为99.35%，证实其为C. scindens菌株。为了研究c-25的系统发育和更高层次的分类，利用来自c-25 16S rDNA序列的前29个BLASTn片段，以及来自其他DCA生产者（C. scindens ATCC 35704T、C. scindens G10和Peptacetobacter hiranonis）的16S rDNA序列，构建系统发育树(图5)。根据NCBI分类数据库，我们只纳入了已建立或提议的种级分类名称的菌株。有趣的是，C. hylemonae是唯一出现在前29片段中DCA的生产者。该树还包括后来在研究中发现的新假设的DCA生产者：Sporofaciens musculi, Dorea sp. AM58-8, Dorea sp. AF36-15AT（表1）。最后，从16S rDNA相似性来看，c-25与L. phocaeense的亲缘关系最为密切，而在前BLAST片段中未检测到其他Lachnoclostridum菌株，我们还增加了3株Lachnoclostridium菌株，通过其与Lachnoclostridium属其他成员的系统发育距离来预测c-25是否属于Lachnoclostridium属：Lachnoclostridium edouardi Marseille-P3397 (NZ_OESQ01000006)、Lachnoclostridium pacaense Marseille-P3100 (NZ_LS999944)和Lachnoclostridium phytofermentans ISDg (NC_010001)。因此，共有39株菌株被纳入系统发育树(图5)。结果表明，Eubacterium sp. c-25与L. phocaeense亲缘关系最为密切，与其他已知DCA产生菌如C. scindens、C. hylemonae和P. hironis有较远的距离。然而，出乎意料的是，其他近亲属并不包括额外的Lachnoclostridium物种，而是在Eubacteriales目的Drancourtella属, Massilistercora属和Mordavella属。此外，其他Lachnoclostridium物种也不聚集在一起，因为被预期来自同一属成员。这些结果表明，Eubacterium sp. c-25可能是Eubacteriales目中的一员，但由于Lachnoclostridium属的分类地位不明确，在科和属水平上无法进行正确的分类。为了获得c-25的可靠分类信息，需要对其分类学进行重新审查，并对包括L. phocaeense在内的分类单元名称进行有效发表。

表1 用于生物信息学分析的菌株的基因组信息。

1 IMG分类单元的ID。

表2 完整的基因组序列信息。

图4 Eubacterium sp. c-25、L. phocaeense和其他与DCA产生相关的菌株之间的ANI热图。使用表1所列菌株进行ANI分析。通过OAT生成热图，并在原始输出的基础上进行高分辨率重构。

图5 Eubacterium sp. c-25及其相关菌(包括已知DCA产生菌)的最大似然系统发育树。构建树的菌株包括29个与Eubacterium sp. c-25最接近的16S rDNA序列BLASTn(不包括未培养和未识别的菌株)匹配，以及另外10个人工添加的菌株：L. phocaeense Marseille-P3177, C. scindens G10, C. scindens ATCC 35704T, P. hiranonis DSM 13275, S. musculi WCA-9-b2, Dorea sp. AF36-15AT, Dorea sp.AM 58-8, Lachnoclostridium edouardi Marseille-P3397 (NZ_OESQ01000006), Lachnoclostridium pacaense Marseille-P3100 (NZ_LS999944)和Lachnoclostridium phytofermentans ISDg344 (NC_010001)。本研究中用于生物信息学分析的菌株被加粗。树是在MEGA X中使用Tamura-Nei模型构建的，有1000个bootstrap，并在中点生根。bootstrap支持值列在分支的旁边。

4 bai基因的鉴定

全基因组同源基因的分类从c-25和其他DCA生产者使用OrthoFinder允许发现了一组基因，在c-25 (EUBC25_24880-EUBC25_24960, EUBC25_02220)和G10 (CSCING10_002180 CSCING10_002270)，被预测为C. scindens ATCC 35704T 同源的bai基因(S1补充文件)。预测的c-25 Bai蛋白与C. scindens ATCC 35704T的蛋白序列相似性低得惊人，但BaiH蛋白除外(图6)。当地BLASTp搜索证实，c-25基因组编码的其他蛋白质与C. scindens ATCC 35704T Bai蛋白的序列相似性大于OrthoFinder发现的蛋白质，这支持了它们作为bai基因同源物的预测。假设的c-25 bai基因的基因排列与C. scindens有很大差异(图7)。与C.scindens的整个bai基因簇由单个启动子控制并产生单个多顺反子mRNA不同，似乎c-25的bai基因被分离成多个基因簇，这些基因簇可能来自不同的启动子位点(启动子预测信息见表S4)。在c-25中，baiA2BGF和baiCDE分别构成一个基因簇，而baiH和baiI与其他bai基因不共享一个启动子。预测胆汁酸调控元件(barA, barB)被认为参与转录调控的基因被发现在baiA2BGF集群的上游。此外，baiI位于一个单独的染色体区域，远离其他的bai基因。重要的是，在c-25中没有发现baiG同源物。相反，在baiB下游存在一个与C. scindens BaiG转运体相似的MFS转运体基因，但其氨基酸序列一致性较低(22%，E-value 0.013, BLASTp)。我们假设这种类似于baiG的转运蛋白是baiG的功能性同源物。对C. scindens G10的基因组也进行了同样的分析。这些分析发现了一个与C. scindens ATCC 35704T几乎相同的bai操纵子结构(基因排列与图1b相同，bai蛋白的氨基酸序列约100%相同)，与预期的同一物种成员相同。结果证实了C.scindens G10在DCA产量和其7α-去羟基化能力的基因组基础上均属于传统的7α-去羟基化物种。

图1 bai蛋白质和bai基因参与了CA形成DCA的过程。(a)Funabashi等人研究了C. scindens VPI 12708中CA和 DCA的7α-去羟基化过程，包括bai蛋白质和中间产物。(b)研究了C. scindens VPI 12708和ATCC 35704T中bai操纵子的排列。bai蛋白在bai操纵子中由它们各自的基因进行颜色编码。

图6 已知和新鉴定的bai基因氨基酸序列识别热图表，假设的DCA生产者。c-25最接近的亲缘种为L. phocaeense。利用BLASTp分析(a) C. scindens ATCC 35704T和(b) Eubacterium sp. c-25参考bai基因作为查询，评估氨基酸序列的同源性(%)。BLAST期望值(E-values)在括号中给出。较暗的方框表示较高程度的序列一致。ND =未检测到。bai基因标识信息见表S1。

图7 在C. scindens G10, Eubacterium sp. c-25, Dorea sp. AF36-15AT, Dorea sp. AM58-8和S. musculi中观察到的bai基因排列。共享基因(或预测的功能同系物在baiG的情况下)是彩色编码的。

5 CA存在下bai基因的表达分析

由于成功地在Eubacterium sp. c-25中鉴定出了bai候选基因，我们利用baiB、baiCD和baiH的特异性引物进行了qRT-PCR分析。本分析的目的是通过检测CA在C. scinden中的诱导表达水平来验证假设的bai基因的身份，并将每个基因的表达水平与C. scindens G10中的表达水平进行比较。值得注意的是，在CA缺失的情况下，C. scindens ATCC 35704T中的bai基因在基础水平上被转录，而且可以下调到更低的表达水平。我们预计baiB、baiCD和baiH的相对基因表达水平在G10中是相似的，在G10中它们是从单个启动子位点转录的，而在c-25中它们的相同基因表达水平则显示更多的差异。选择这些bai基因是因为它们代表了c-25中三个主要的bai基因簇，并且也被报道为7α-去羟基化所必需的。此外，baiB是C. sciindens bai操纵子中第一个转录的基因，baiH是倒数第二个转录的基因，覆盖了整个bai操纵子。 qRT-PCR结果显示，在CA存在的情况下，G10中baiB、baiCD和baiH的bai基因表达分别增加了67.3倍、29.8倍和16.6倍(图8a和表S5)。在c-25中，这些基因的表达增加了218.8、291.8和13.9倍(图8b和表S6)，表明预测的bai基因同源物在c-25中是功能性bai基因。然而，bai基因在c-25中的表达水平有相当大的差异，baiB和baiCD的表达水平大约是baiH的15倍20倍。在G10中，bai基因表达水平相对相似，并且如预期的那样，在操纵子中按下游顺序下降。

图8 qRT-PCR结果显示，添加或不添加CA时，baiB、baiCD和baiH基因的表达。表达测量(a)C. scindens G10 (n = 3)和(b)Eubacterium sp. c-25 (n = 7)。细胞在调节pH值为8的GAM 中培养，在存在(CA)或不存在(对照)0.1 mM CA的情况下收集并在指数中期生长阶段进行总RNA提取。给出了每个基因相对于参考管家基因recA的表达水平的平均值。误差棒表示平均值的标准误差。p值低于0.05被认为是显著的，并在面板中用星号表示(*:p ＜0.05， **: p＜0.01，***: p＜0.001)。

6 7α-去羟基细菌的鉴定

最后，我们寻找其他可能具有与c-25相似的bai基因结构和排列的细菌。由于在c-25中发现Bai蛋白序列与传统DCA生产者有很大的不同，我们使用c-25中的BaiB进行了微生物蛋白BLAST搜索。通过对分离菌株和测序菌株进行筛选，发现3株菌株与c-25 BaiB基因相似度为74-77%：Sporofaciens musculi、Dorea sp. AF36-15AT和Dorea sp. AM58-8。各品系均证实存在其他bai基因。这三种菌株的bai基因排列与c-25几乎相同(图7)，只是在S. musculi中，在baiA2-F操纵子的下游端额外编码了一个转运体基因，baiI基因位于baiH的下游。在c-25中发现的像baiG的转运蛋白也在这三个新的候选菌株中类似位置发现(图7)。

讨论

本研究明确了独特但被遗忘的次级胆汁酸产生菌Eubacterium sp. c-25的形态、生长、胆汁酸代谢和基因组信息。长期以来，已知肠道DCA产生者的名单一直局限于少数几种物种，在几十年的研究中，几乎没有发现新的分离物。此外，目前的DCA形成模型主要基于C. scindens研究收集的数据。而人类粪便分离Eubacterium sp. c-25已被证实能产生DCA，但在本研究中获得的生理和基因组数据挑战了当前DCA生产者的认识，揭示了其独特的形态(图2)，依赖于特定的pH值最佳生长条件和7α-去羟基化(图3)，以及一种新的bai基因排列，这可能代表了DCA产生者中完全未被探索的基因型，其存在多个系统发育上遥远的肠道/粪便分离株:S. musculi、Dorea sp. AF36-15AT和Dorea sp. AM58-8(图6和7)。

在其他DCA生产中未观察到c-25的丝状形态。C. scindens、P. hiranonis和C.hylemonae的图像显示它们具有相似的杆状形状，但任何可见的端到端连接仅限于两个或三个细胞链。在各种肠道细菌中都可以观察到丝状形态，包括乳酸菌和双歧杆菌，但对于丝状梭菌的报道很少，因为它们主要是不相连的。这进一步支持了我们的发现，即c-25在系统发育上不同于已知的DCA生产者。

16S rDNA系统发育分析结果表明，从分类上看，c-25属于Eubacteriales目(图5)。然而，由于其最近亲缘物种L. phocaeense的分类命名存在问题，目前Lachnoclostridium分类方案中，很难正确分类c-25。

从图3中可以看出，包括c-25在内的所有被试菌株的生长和DCA的产生在很大程度上依赖于培养基的pH。一个有利于体外生长和7α-去羟基化的pH范围可能暗示了胃肠道环境中的定殖偏好。C. scindens似乎能够在较宽的pH范围内增殖，而c-25可能局限于中性或微碱性环境。窄的pH范围可能有利于该菌株在c-25范围内生长，限制该菌株向具有较高pH值的特定个体或胃肠道截面的生长。例如，尽管不同研究的结果和测试方法不同，但似乎有一个普遍的共识，即近端结肠pH值范围约5.8-6.7左右，在远端结肠和直肠中则上升到6.1-7.5。克罗恩病（Crohn’s disease）和溃疡性结肠炎患者的胃肠道pH值也出现升高。虽然c-25在人类肠道中的流行率尚不清楚，但有可能该菌株占据了一个特定的生态位，如远端结肠，或者在不规则的生理条件下大量存在，导致肠道pH值增加，这表明pH值可能被用作与DCA产量增加相关的疾病状态的标记。近年来，虽然生理pH值与定殖之间的联系尚未得到专门研究，但利用纳米级二次离子质谱和宏蛋白质组学分析对接种的C. scindens在灵生小鼠模型中的定位特异性定殖进行了研究。为了进一步研究c-25和其他DCA生产者的生态位，有必要引入这些先进的技术，并专门针对肠道pH随位置和个体的变化进行研究。

长期以来，7α-去羟基化的需要是诱导baiA2-I基因簇，该基因簇由单个启动子控制并产生单个多顺反子mRNA。虽然最近发表的一项宏基因组组装基因组分析发现，bai基因簇的不同排列与C. scindens中发现的排列不同，但还没有菌株被实验证明能够产生DCA。在c-25中发现了独特排列但具有明显功能的bai基因簇，以及它在其他细菌中的存在，需要重新检查DCA生产者的多样性和7α-去羟基化的遗传基础。如图8所示，c-25在CA存在时，baiB和baiCD的表达显著增加，相比之下，CA诱导的baiH表达量增加不大。这种不成比例的诱导与c-25 bai基因被分成多个单独转录的基因簇的事实相一致，但提出了bai基因表达在c-25中如何协调和调控的问题。这些高表达bai基因的生理和代谢影响需要进一步研究，这可能有助于深入了解影响DCA在胃肠道环境中形成的因素。

通过对c-25和C. scindens的bai基因的比较分析，提出了其功能和保存的几个问题。首先，虽然我们假设像BaiG蛋白是胆酸转运蛋白BaiG的功能性同源物，但这还有待实验证实。由于它与C. scindens的BaiG蛋白只有22%的氨基酸序列相同，因此在蛋白质结构和生物功能上可能存在较大差异。其次，baiI被认为编码了7β-脱水酶，参与熊胆酸(具有7β-羟基的CA的外分子)的7β-去羟基化成DCA，在先前分析的DCA产生物的bai操纵子中发现，该基因并没有与c-25中的其他bai基因或两个Dorea种与c-25有着相同bai基因排列。由于baiI实际上已经被证明在体外对7α-去羟基化没有必要，有可能只有当底物具有7β-羟基时，baiI在c-25和两种Dorea物种中才有差异表达。第三，与其他bai基因相比，c-25和C.scindens中的baiH具有很高的相似性(图6)，说明它在7α-去羟基化过程中具有重要作用，是一种不可替代的蛋白。最近的一项研究表明，在宏基因组数据集鉴定的同源基因中，baiH及其同源基因baiCD的蛋白质序列似乎比其他bai基因保守程度更高，但在本研究中，c-25的baiCD序列一致性不高。c-25中其余的白族基因均表现出低蛋白质序列相似性，同源率约为50%(图6)。由于7α-去羟基化酶级联的每一步都需要复杂的生化修饰，我们期望DCA生产者具有更高程度的bai基因守恒。然而，在c-25和C.scindens之间观察到的低蛋白质相似性，以及可能由不同的基因安排导致的不同水平的差异表达，表明DCA生产者之间的基因型变异性可能比之前预期的更多。

在Eubacterium c-25中发现的独特的bai基因排列在其他细菌(如S. musculis 和 Dorea spp.)中发现，这一观察有力地证明了肠道DCA产生者中存在替代bai基因型。大规模宏基因组分析表明，bai基因在肠道微生物群落中比之前认为的更常见，这就提出了一个问题，即除了迄今发现的少数DCA生产者之外，还对其实际数量和多样性提出了质疑。

转自：微生态