启动子—高效基因表达的钥匙，别选错了！！！

确保外源基因在细胞或者动物体内，持续和高水平的表达具有广泛的应用需求及科研价值。当前递送外源基因的生物学手段，主要是运用质粒或者病毒作为媒介表达基因，而启动子是实现基因表达的基础元件。但是，经常有老师反馈，为什么基因表达不强呢？为什么细胞传代几次之后就不表达了呢？今天，小编带您盘点下，常用的组成型启动子表达效率与细胞的关系。

启动子是位于结构基因上游的一段可以行使转录起始功能的序列，结构如下：

根据其对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同，分为三类，常用的启动子是Ⅱ、Ⅲ两种启动子。其中，Ⅲ型启动子主要表达非编码的短序列RNA，比如shRNA、miRNA等，我们常说的启动子，或者细胞里面常规基因的启动子，几乎都是Ⅱ型启动子，其特点是转录产物长度不限，编码与否不限等特点。

酶的种类1

存在

功能

对抑制物的敏感性

RNA聚合酶I

核仁

合成rRNA前体

不敏感

RNA聚合酶II

核质

合成mRNA前体及大多数snRNA

敏感

RNA聚合酶III

核质

合成5S rRNA前体、tRNA前体及其他的核和胞质小RNA前体

存在物种特异性

Ⅱ型启动子在使用特点上又可分为三大类：组成型启动子、特异性启动子、诱导启动子。特异性启动子只能在特定细胞表达，因此适合动物实验使用；诱导启动子需要加入特定的药物才能激发或者抑制其活性，如四环素诱导TRE表达；而表达系统中，运用最多的则是组成型启动子，这类启动子在绝大部分细胞里面都能维持一定的表达活性，当然，不同的启动子也有高低表达之分。

载体上最常见的组成型启动子包含：β-肌动蛋白启动子（ACTB），巨细胞病毒（CMV），延伸因子-1α（EF1α），磷酸甘油酸激酶（PGK）、泛素C（UbC、本文别名FCIV），具有CMV最大内含子的CMV启动子/增强子（CMVi启动子）、巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG，猿猴病毒来源的SV40等。其中，最常见的是CMV启动子，在大量的商业化载体上如pcDNA3、pEGFP使用，病毒上最常见启动子是CMV、EF1α，说明这些都是高表达启动子，那么所有细胞系都合适吗？小编收罗了不同文献、不同细胞类型的验证实验，接着往下看：

混合细胞系

作者选了多种来源的细胞，包含成纤维细胞、肿瘤细胞、干细胞、高度分化的肌肉细胞等，使用六个哺乳动物组成型启动子，每个都插入GFP包装成慢病毒转导细胞，通过流式细胞仪对GFP强度进行定量：

小鼠尾巴成纤维细胞（129TF），小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），小鼠成肌细胞（C2C12），大鼠间充质干细胞（MSC），人成纤维细胞（MRC5），人纤维肉瘤细胞（HT1080），人胚胎肾细胞（293T）和恒河猴猕猴乳腺肿瘤细胞（CMMT）

结果表明：UBC跟PGK始终是弱的，SV40相对较强，EF1A和CAG启动子在所有细胞类型中均具有较强的一致性，CMV启动子是最多变的，是在一些细胞类型（很强烈例如，293T和CMMT）和其他（较弱例如，MRC5和MSC）。

由此看出，CMV在肿瘤细胞系倾向高表达，而EF1A和CAG在大部分细胞表达趋于稳定，且这三个高强度启动子在干细胞等类型活性都有所下降。所以，针对常规的肿瘤细胞系，常规体细胞系，三个启动子的效果还是不错的，但由干细胞表达效果差，推导出非常规的细胞系，如悬浮细胞系、神经细胞等，启动子如何选择呢？

胚胎干细胞（hESCs）

干细胞相对复杂，因为还存在分化过程的干细胞，那么干细胞对于启动子的选择有何特点呢？

对hESCs中ACTB，CMV，EF1α，PGK和UbC启动子的活性进行了比较研究。选择慢病毒介导的基因转移作为基因传递系统，通过FACS分选出了eGFP +细胞,结果如下：

1.未分化的hESCs的启动子活性

在FACS分选后的15、30和50天测量启动子活性，通过OCT3 / 4，NANOG和hES-Cellect（Cellartis AB）多能蛋白的标记证实了eGFP +细胞的多能性：

第0天，所有启动子的eGFP+百分比约为98％，第30天，ACTB，EF1α和PGK的启动子活性均相等，第50天，CMV-eGFP+细胞的百分比降低于10％，EF1α也出现下降。

2. 分化的hESCs中的启动子活性

慢病毒介导GFP的将hESC系SA121，在第0天（d0），未分化状态第22天（undiff），分化为胚状体22天（EB），测试GFP +细胞的比例，结果显示，启动子在分化过程中被显著下调，并且在大约50％的分化细胞中没有活性。EF1α是分化过程中最稳定的启动子；CMV启动子仅在细胞的一小部分（约15％）具有活性。

总之，就长期保持未分化的hESCs的转基因（eGFP）表达而言，ACTB，EF1α和PGK启动子是最稳定的启动子；而在分化过程中，成型启动子的活性会下降，相对而言，EF1α启动子具有最高的稳定性。原因即细胞在分化过程中，所表达的转录因子是有差异的，部分启动子表达所需的转录因子丢失，同时染色体结构的改变影响了外源插入序列的状态，导致启动子出现沉默现象。

造血干细胞（HSC）/祖细胞

造血干细胞（HSC）具有自我更新和多谱系分化成所有成熟血细胞的潜力。因此，有效转导至HSCs将提供治疗因血细胞功能异常而导致的多种疾病的机会，并且将成为研究HSCs增殖，分化和运输调节的有力工具。作者构建了携带多个启动子表达荧光的腺病毒，感染两种状态的造血细胞，以流式检测：

成熟CD34+ 成熟CD34+

免疫细胞

结果显示：当用于造血细胞中时，CMV启动子倾向于沉默。转基因可能以非常低的水平表达或无法检测。EF1α、CMVi和CAG启动子在转导人骨髓CD34+细胞方面表现优异。特别地，CAG启动子在CD34+细胞和未成熟的CD34+亚群中最有效地发挥作用。

当前，以CAR-T和TCR-T为代表的细胞治疗非常火热，前者都需要运用慢病毒感染T细胞。免疫类细胞，诸如T细胞，病毒感染难度较大，启动子的选择得注意。

作者构建多个启动子的慢病毒载体表达荧光，感染经过IL-2刺激过的PBL细胞，以FACS检测，观察到CMV启动子在原代T细胞驱动效率低，CAG也相对较差，其余几个启动子的效率相近，都在60%上下。

进一步以以抗CD3抗体OKT3刺激细胞，再进行实验，活化后的T细胞，多个启动子的表达效率得到增强，其中以MSCV启动子最优。

在PBL中，发现含有MSCV启动子的载体最适合，在最低程度刺激的淋巴细胞和高度活化的淋巴细胞中的表达。当然，文章没有比较EF1α，实际后者在T细胞也有不俗的表达水平。

神经细胞

用CMV-GFP，PGK-GFP，MND-GFP和泛素C启动子（FCIV）转导了含有神经元和星形胶质细胞的小鼠新皮层培养物。转导后四天，我们对神经元（NeuN阳性）进行检测，在FCIV转导的培养物中85％的神经元表达了GFP，PGK为55.2％，且大多数报告基因阳性细胞与NeuN共定位；而CMV为4.1％、MND为0.7％。且几乎与NeuN染色的细胞不重叠，说明后两者不适合神经元的表达。

以上述病毒转导来自SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系，结果显示：CMV，PGK和FCIV在未分化和分化的神经母细胞瘤细胞中均具有活性，但CMV启动子活性最高，尤其是在分化后（小脑颗粒神经元显示出相同的结果，数据见原文）。

对于涉及原代皮层神经元培养的研究，UBC和PGK启动子可能是基因表达的最佳选择。UBC，PGK，CMV和MND启动子均适用于转导原代星形胶质细胞。在小脑颗粒细胞和分化的SH-SY5Y神经母细胞瘤培养物中，CMV启动子指导最稳定的转基因表达。

总结

通过本文一系列细胞及使用启动子的使用情况的整理，我们可以得出如下结论：

1.CMV启动子作为最为广泛使用的启动子，适合在肿瘤细胞、肌肉、肝脏等体细胞或者贴壁细胞的表达，而不适合大多数干细胞、悬浮细胞及原代细胞的表达；

2.EF1α启动子适合干细胞、原代细胞、造血细胞等的表达，在常用细胞如HEK293、肿瘤等细胞系中弱与CMV；

3.部分细胞在传代过程中，外源启动子会出现沉默现象，不同的启动子沉默效率有所差异，对于少见的细胞系，或者会分化的细胞系，研究者需要考虑启动子的选择，或者多做些分组；

4.CAG启动子在不少细胞系，诸如免疫细胞、体细胞，有不次于CMV的表达效率，也是基因表达的一个较优选择的启动子。

实际上，常用于表达外源基因的启动子主语局限于CMV、EF1α、CAG、UBC等，本文涉及的PGK、SV40等主要用于表达荧光、抗性等，很多载体出现荧光弱等问题，可以看看表达荧光用的何种启动子。当然，诸如悬浮细胞还可以使用SFFV等启动子实现高表达（可参考吉凯基因悬浮病毒载体使用手册）。总之，启动子的选择对于基因的表达至关重要，吉凯也开发了更加高效表达的启动子系列，对于基因表达弱，荧光弱的老师们，快来吉凯咨询吧！！！

【参考文献】

1.Systematic Comparison of Constitutive Promoters and the Doxycycline-Inducible Promoter

2.Quantitative Comparison of Constitutive Promoters in Human ES cells

3.Optimization of adenovirus serotype 35 vectors for efficient transduction in human hematopoietic progenitors: comparison of promoter activities

4.Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells

5.Lentiviral Vector Design for Optimal T Cell Receptor Gene Expression in the Transduction of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor-Infiltrating Lymphocytes