Hi-C辅助组装知多少，硬核知识点来了~

高质量的参考基因组是研究物种进化、性状定位、基因表达调控等生物学问题的基础，但目前二代+三代的测序策略，只能够将基因组组装到Contig/Scaffold水平，无法获得染色体水平的基因组信息。而 Hi-C辅助组装技术可将Contig/Scaffold挂载到不同的染色体上，提升基因组质量，在基因组文章的发表中扮演了不可或缺的角色。下面，小编将与大家分享一些Hi-C辅助组装技术的小知识~

Hi-C辅助组装实验流程

利用甲醛对样本进行交联，质检合格后使用限制性内切酶（如MboI等）进行酶切，酶切片段经生物素标记、平末端连接、DNA纯化提取，超声打断后钓取含有生物素的片段，进行建库测序。随后，对原始下机数据进行质控，并将质控截取后的Clean reads与参考基因组比对，获得用于互作分析的Valid reads。由于Hi-C文库的构建具有一定的复杂性，在实际的项目执行过程中，会先通过对小规模的测序数据进行评估，以检测所构建文库的质量。小数据评估合格后，启动大数据的上机测序，以保证测序数据的质量。

图1. Hi-C辅助组装实验流程图[1]

Hi-C数据处理

目前常用的Hi-C数据处理软件是HiC-Pro，该软件采用两步比对策略，有效提高了数据的利用率的同时，还提供了一系列的质控标准，对文库质量进行评估[2]。此外，HiC-Pro还具有从原始数据到归一化之后的Hi-C图谱构建的完整功能，内含迭代校正算法的优化版本，可显著加快和促进Hi-C数据的标准化。

图2. HiC-Pro算法示意图[2]

Hi-C辅助组装常用软件

目前，用于Hi-C辅助基因组组装的软件有LACHESIS、SALSA2、3D-DNA、ALLHiC等，这些软件在基因组组装方面各有优劣。

LACHESIS

LACHESIS（ligating adjacent chromatin enables scaffolding in situ）是华盛顿大学于2013年研发的一种基因组组装方法，它通过聚类算法将初步组装的Contig/Scaffold分配到各染色体群中，基于染色体内部不同区段间的互作强度高低对每个染色体群组中的Contig/Scaffold进行排序和定向，将基因组草图提升到染色体水平[3]。LACHESIS是分析Hi-C数据的经典工具，目前已发表的Hi-C辅助组装文章多基于该算法，文章认可度较高。但LACHESIS在多倍体基因组组装方面具有一定的局限性，且该算法目前已停止更新。

图3. LACHESIS算法示意图[3]

SALSA2

SALSA是最早提出利用Hi-C对Contig进行纠错的软件，优化后的SALSA2提出了一种新的染色体划分方式，即检查每次迭代后是否存在错误的合并（mis-join），且该算法不需要预先设定染色体的数目，在一定程度上提高了Scaffold精确度[4]。但该算法会引入很多聚类/排序/定向错误，且在运行过程中可调参数较少，因此利用率一般。

图4. SALSA2算法流程示意图[4]

3D-DNA

2017年Dudchenko等人通过3D-DNA（3D de novo assembly）实现了对基因组草图先纠错再组装的功能[5]。使用3D-DNA做基因组组装的整体流程包括组装、Juicer分析Hi-C数据、3D-DNA进行Scaffolding、使用JBAT对组装结果进行手工纠正，最终得到准染色体水平的基因组。但该软件的纠错功能并没有得到很好的应用：在模拟数据情况下3D-DNA的组装错误率是SALSA2错误率的2-4倍[4]，且Juicer在多倍体物种上表现不佳。

图5. 3D-DNA算法示意图[5]

ALLHiC

SALSA2、3D-DNA、LACHESIS等软件在动物基因组和简单植物基因组的Hi-C辅助组装上表现都不错，但在多倍体物种和高杂合物种中，由于等位基因序列的相似性，可能会使得不同染色体组之间的Contig出现假的互作信号，导致组装错误。而ALLHiC算法可通过修剪Hi-C平行信号和弱信号，将等位基因和同源序列分隔在不同的单倍型内独立组装，有效解决了多倍体物种和高杂合度基因组的辅助组装难题。此外，ALLHiC还通过优化算法，改进了Contig的排序和定向，尤其是连续性较低的Contig，极大地提高了短序列的排序和定向的准确性[6]。

图6. ALLHiC算法示意图[6]

总结

SALSA2和3D-DNA虽不需预先提供染色体数目即可进行互作分析，但在可操作性和实用性上都有一定的局限性。LACHESIS作为分析Hi-C数据的经典工具，文章认可度较高，但其在多倍体基因组组装方面表现欠佳。相对而言，ALLHiC除了将等位基因和同源序列分隔在不同的单倍型内独立组装外，还通过算法优化，提高了对序列的排序和定向的准确性。因此，ALLHiC不但适用于多倍体基因组组装，还可用于简单的二倍体基因组、高杂合基因组组装。值得注意的是，LACHESIS和ALLHiC需预先提供准确的染色体数目，才能对Contig/Scaffold进行聚类、分群。

安诺基因在LACHESIS常用功能的基础上，通过对分析流程进行优化，增加了热图纠错功能，显著提升了实际项目中基因组的组装效果。在多倍体和高杂合基因组组装方面，安诺基因采用ALLHiC算法，为高质量基因组的获得提供保障。基于Hi-C辅助组装技术，安诺基因已与中国农业大学、中科院遗传与发育所、中国海洋大学、中国农业科学院、浙江大学、福建农林大学等多家科研院所开展了深度合作，助力基因组文章发表于Nature、Nature Plants、Nature Communications、Molecular Plant、Communications Biology、The Plant Journal 等多个国际高水平期刊。

参考文献

[1] Lieberman-Aiden E, Van Berkum N L, Williams L, et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome[J]. Science, 2009, 326(5950): 289-293.

[2] Servant N, Varoquaux N, Lajoie B R, et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing[J]. Genome Biology, 2015, 16(1): 259.

[3] Burton J N, Adey A, Patwardhan R P, et al. Chromosome-scale scaffolding ofde novo genome assemblies based on chromatin interactions[J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(12): 1119.

[4] Ghurye J, Rhie A, Walenz B P, et al. Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly[J]. bioRxiv, 2019: 261149.

[5] Dudchenko O, Batra S S, Omer A D, et al. De novo assembly of the Aedes aegypti genome using Hi-C yields chromosome-length scaffolds[J]. Science, 2017, 356(6333): 92-95.

[6] Zhang X, Zhang S, Zhao Q, et al. Assembly of allele-aware, chromosomal-scale autopolyploid genomes based on Hi-C data[J]. Nature Plants, 2019, 5(8): 833-845.