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最常用的生信分析在线数据库＋最简单的生信分析思路=2021年10月发表在Frontiers in genetics（IF：4.772）的肺腺癌生信分析文章——《 RAB11FIP1: An Indicator for Tumor Immune Microenvironment and Prognosis of Lung Adenocarcinoma from a Comprehensive Analysis of Bioinformatics》。

文章共8图4表，以TCGA_LUAD数据集为分析对象，使用Oncomine、HPA、LinkedOmics、cBioPortal、STRING、TIMER与GEPIA等7个高频使用的生信分析数据库，以RAB11FIP1基因为主变量，免疫浸润分析为重点，纯生信分析的手段分析了肺腺癌中RAB11FIP1的异常低表达与肿瘤的预后等关联。今天这篇推文带大家快速领会文献分析套路，5分钟看完全文，手把手教大家一小时学会全文每张图表的完整复现~

题目：RAB11FIP1: An Indicator for Tumor Immune Microenvironment and Prognosis of Lung Adenocarcinoma from a Comprehensive Analysis of Bioinformatics

期刊信息

1.材料与方法

1）疾病：肺腺癌

2）物种：人类

3）数据来源：TCGA LUAD（n=515）

2.图标结果及复现

2.1 使用工具

1）仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products）

2）HPA数据库（ https://www.proteinatlas.org)

3）LinkedOmics数据库（ http://www.linkedomics.org/admin.php)

4）cBioPortal数据库（http://www.cbioportal.org/)

5）STRING数据库（https://cn.string-db.org/)

6）TIMER数据库（ https://cibersortx.stanford.edu/)

7）GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/)

2.2复现任务

Figure 1| RAB11FIP1 expression levels in LUAD.

RAB11FIP1在肺腺癌中的表达水平

Figure 2| Tranion of RAB11FIP1 stratified by gender, age, and other criteria in a subgroup of patients with lung cancer.

RAB11FIP1在肺腺癌不同亚组中转录水平

Table 1| Association between RAB11FIP1 expression and clinicopathologic parameters by Logistic regression.

Logistic回归分析RAB11FIP1表达水平与临床病理参数关联

Figure 3| Relationship between RAB11FIP1 and prognosis in LUAD.

RAB11FIP1表达水平与LUAD预后关联

Table 2| Univariate and multivariate Cox analysis of clinicopathological parameters and OS in patients with LUAD.

LUAD患者临床病理参数单、多因素Cox分析表格

Figure 4 | GSEA with GO term and KEGG pathway.

GO条目与KEGG通路GSEA富集分析

Figure 5|Correlation between gene differential expression and RAB11FIP1 in LUAD中基因差异表达与RAB11FIP1的相关性

Figure6|GO annotation and KEGG pathway in lung cancer. The GO annotation and KEGG pathway of RAB11FIP1 co-expressed genes in lung tissue were analyzed by GSEA.

GSEA分析LUAD中RAB11FIP1共表达基因的GO注释和KEGG通路

Figure7| Top two modules from the PPI network.

PPI网络的Top2 核心模块

Figure 8 | Relationship between expression of RAB11FIP1 and level of immune invasion in LUAD

LUAD中RAB11FIP1表达与免疫浸润水平的关系

Table3|Correlation analysis between RAB11FIP1 and marker genes of immune cells in TIMER

TIMER数据库分析RAB11FIP1基因与免疫细胞标志基因相关性

Table 4|Correlation analysis between RAB11FIP1 and TIICs marker genes in GEPIA.

GEPIA数据库中RAB11FIP1和TIICs标记基因的相关性分析

3.复现步骤

3.1 Fig.1 RAB11FIP1在肺腺癌中的表达水平

1）图1 A-F为Oncomine 4.5 数据库中RAB11FIP1在不同数据集中正常肺与肺腺癌中表达比较箱式图，由于Oncomine数据库在2022年1月17日已停止使用，此图无法复现；我们可以看到主变量RAB11FIP1分子在肿瘤组织中表达显著降低

2）图1 G为TCGA数据库中LUAD数据集配对样本表达比较，同样也是肿瘤组织中RAB11FIP1表达显著减少。进入“仙桃学术—生信工具——表达差异——[云]配对样本”，选择“TCGA_LUAD”数据集，右侧的“基因”处输入“RAB11FIP1”，选择对应的分子信息，提交分析，得到原文同款TCGA_LUAD数据集配对样本RAB11FIP1 表达差异比较连线图。图例、图性色彩及透明度等均可实现个性化调整，实现满意的效果后保存结果，下载图片，查看统计描述与分析报告，可看到TCGA_LUAD数据集配对样本中RAB11FIP1在肺腺癌组中表达显著降低

3）图1 H为HPA数据库中RAB11FIP1蛋白在正常肺组织（上）与肺腺癌组织（下）中免疫组化结果图片，HPA数据库在生信文章中作为表达差异实验辅助结果出现的频率非常高，数据库简洁易上手，首先进入HPA数据库官网（https://www.proteinatlas.org），输入目标分子“RAB11FIP1”，选择“TISSUE”，左侧选择组织类型为“LUNG”，即可看到原文中的同款正常肺组织IHC图片，点击进入详情页面，保存图片即可；回到起始页，输入目标分子“RAB11FIP1”，选择“PATHOLOGY”，左侧“PATHOLOGY”选择”LUAD“，就看到了原文中同款肺腺癌染色图片

3.2 Fig.2RAB11FIP1在肺腺癌不同亚组中的转录水平

图2 A-F为使用UALCAN数据库绘制的TCGA数据集中RAB11FIP1分子在正常肺组织与肺腺癌组织、性别亚组、肿瘤T分期亚组、N分期亚组、年龄亚组与人种亚组的表达分析

进入“临床意义（靠）——[云]临床相关性“，选择TCGA_LUAD数据集，每次选择一个亚组类型，依次选定亚组内因子顺序，右侧”分子“中选择“RAB11FIP1”，提交分析，得到原文同款亚组比较箱式图；依次完成目标亚组分析，仙桃学术页面拉下，还非常非常友善提供了整理好的TCGA表达谱文件下载链接噢~

3.3 Table1Logistic回归分析RAB11FIP1表达水平与临床病理参数关联

Table1为RAB11FIP1单基因logistic回归分析，即以分类临床变量逐个作为logistic回归方差的因变量，RAB11FIP1基因为自变量，使用logistic回归的方法分析目标基因对于临床变量的推断效能，评估单个基因和临床变量之间的关系

进入“临床意义（靠）——Logistic回归——[云]单基因logistic回归“，选择数据集，右侧为目标分析的单个基因，选择原文中的临床变量：gender、stage（pathologic stage）、tumor size（T stage）、lymph node metastasis（N stage）与distant metastasis（M stage），提交分析，保存结果并下载word三线表

3.4 Fig.3 RAB11FIP1表达水平与LUAD预后关联 & LUAD患者临床病理参数单、多因素Cox分析表格

1）图3 A-C为RAB11FIP1分子（3种探针）的表达水平与LUAD生存预后KM曲线图，可以看到RAB11FIP1低表达组预后更差。进入“临床意义（靠）——预后分析——[云]KM曲线图，选择数据集与主变量分子，提交分析，即可得到根据分子表达水平分为高、低组的KM曲线图，图中的“+”表示删失数据，KM曲线下降越缓慢则预后越好

2）图3 D为age、gender与RAB11FIP1 三个变量的多因素Cox回归分析森林图，进入“临床意义（靠）——预后分析——[云]单|多因素Cox回归分析”，选择数据集，以及进行单因素Cox回归分析的变量，右侧选择预后类型参数，仙桃学术可选OS（overall survival，总体生存期）、DSS（disease specific survival，疾病特异性生存期）与PFI（progress free interval，无进展生存期），提交分析，保存结果，并下载excel表格，这里的word三线表即为原文中的Table2啦~

3）进入“基础绘图——森林图“，查看教程文档，按文档要求格式准备上传文件，这里直接上传刚才下载的excel表格即可，提交分析，保存结果，同样地，图片的颜色、标题等均可在右侧功能区进行修改

3 . 5 Fig.4 GO条目与KEGG通路GSEA富集分析

1）图4为以主变量RAB11FIP1基因表达水平分为2组，对相关基因进行GO及KEGG富集分析。进入“表达差异（挑）——差异分析——[云]单基因差异分析”，选择TCGA_LUAD数据集，右侧“分子”栏目下选择目标基因，提交分析，稍等1-2min分析完成后在历史记录中下载分析结果表格，保留gene name与logFC 2列数据即可，另存为新文件

2）进入“功能聚类（圈）——GSEA富集——GSEA分析”，上传整理好的文件，右侧参考数据集依次选择”c5.all.v7.2.symbols.gmt[Gene ontology]”与”c2.cp,v7.2.symbols.gmt[Curated]”，进行GO与KEGG富集分析，依然在“历史记录”中下载分析结果表格，根据p.adj <0.05 & | NES | >1筛选合格的富集结果，可以选择根据NES排序展示top5结果，也可以选择展示自己感兴趣的表型相关富集结果

介绍：MSigDB数据库将所有的基因集划分为9个大类：H: hallmark gene sets，包含由多个已知的基因集构成的其他类别的基因集；C1: positional gene sets，包含人类每条染色体上的不同cytoband区域对应的基因集合；C2: curated gene sets包含已知数据库，文献和专家支持的基因集信息，包含2个二级分类：CGP（chemical and genetic pertuibations）、CP（Canonical pathways），其中KEGG、REACTOME属于CP子集；C3: regulatory target gene sets，包含转录因子或microRNA调控潜在靶点的基因集，包括MIR（microRNA targets）和TFT （tranion factor targets）2个子集；C4: computational gene sets：通过挖掘大量肿瘤相关芯片数据定义的基因集，包括CGN（cancer gene neighborhoods）和CM（cancer modules）2个子集；C5: ontology gene sets，包含Gene Ontology（GO）、Human Phenotype Ontology（HPO）对应的基因集合；C6: oncogenic signature gene sets，包含在肿瘤中异常的细胞通路特征基因集；C7: Immunologic signature gene sets，代表免疫系统内细胞状态和干扰的基因集；C8: cell type signature gene sets，包含人类组织单细胞测序研究中确定的细胞类型的聚类标记基因集。

2）进入“功能聚类（圈）——GSEA富集——GSEA（可视化）”，选择相应的云端数据集，右侧“基因集ID”处支持手动输入感兴趣的信号通路，”绘制部分“有3种选择，上部分为富集评分情况，如果NES为正，则峰出现在左侧（头部富集）（高表达组富集），NES为负反之；中部分每一根竖线代表基因集中一个分子，分子根据给定的值排序，排序后单独提取当前基因集中定义的分子，分子位置即为图中所示；下部分根据上传数据中分子给定的值归一化后进行可视化，一般无需关注下部分；提交分析，目前仙桃学术支持同时绘制5个基因集，伙伴们也可以选择单独展示自己感兴趣的1-2个基因集，可以显示富集分数，pvalue等参数噢~

3.6 Fig.5 LUAD中基因差异表达与RAB11FIP1的相关性

图5为LinkedOmics数据库中LUAD数据集中差异表达基因与RAB11FIP1分子的相关性热图。

1）进入LinkedOmics数据库（http://www.linkedomics.org/admin.php），LinkedOmics数据库是挖掘TCGA数据的一款经典好用数据库，功能非常强大，数据库使用前使用普通的邮箱注册即可，无需教育邮箱。根据官网首页的step提示，首先STEP1选择分析数据集，在第6页找到LUAD数据集，点击前边的小圆圈选中；STEP2选择数据类型，HiSeq RNA(高通量RNA-seq)，STEP 2b可进一步选择样本信息，为可选项，这里我们选择纳入TCGA_LUAD所有样本；STEP3选择目标基因，输入RAB11FIP1；STEP4中依然选择HiSeq RNA数据集，STEP5选择相关性分析方法，这里与原文一致，选择Pearson相关性分析

2）待分析完成后，选择分析结果，在“LinkedFinder”模块下查看分析结果，网站提供了分析结果下载的选项，大家可以根据需要下载分析结果~分析结果下拉，即可看到与原文同款的差异基因与RAB11FIP1表达相关性分析热图

3.7 Fig.6 GSEA分析LUAD中RAB11FIP1共表达基因的GO注释和KEGG通路

接下来使用相关性基因分析结果进行了GSEA富集分析，进入“LinkInterpreter”模块，“Select Tool”处选择“Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）”，“Enrichment Analysis”处可以分别选择GO分析的BP、MF、CC以及KEGG分析，网站提供了Table、条形图与火山图3种展示形式，点击“Download”可下载结果

3.8 Fig.7 PPI网络的Top2 核心模块

1）图7为RAB11FIP1共表达基因的蛋白互作网络分析。首先进入cBioPortal数据库（http://www.cbioportal.org/）分析LUAD数据集中RAB11FIP1的共表达基因，左侧组织类型选择“Lung“，右侧选择”Lung Cancer“，“mRNA Expression”表达数据，z-score阈值设置默认即可；纳入所有样本，输入目标基因“RAB11FIP1”，提交分析

2）上方的导航栏选择“Co-expression”，查看共表达分析结果，点击云朵样图标下载数据，筛选p.value < 0.05的基因，在18407条记录中共有5047个基因符合筛选条件，基因数目还是过多，文章中对于PPI网络分析的具体参数缺乏相关阈值，这里我们再选择Spearman's Correlation > 0.8的基因再进行一次筛选，可以看到共有137个基因满足条件

3）进入STRING数据库（https://cn.string-db.org/），点击官网首页“SEARCH”进入分析界面，左侧功能栏选择“Multiple proteins”，粘贴刚才筛选后的共表达基因，物种选择“Homo sapiens”，提交分析，之后点击“Continue”，得到蛋白-蛋白互作网络图，将网络导出至Cytoscape软件

5）图7C、D为模块基因的富集分析结果表格，下载模块分析表格，“selected“中筛选”TRUE“，复制18个核心基因，进入仙桃学术”功能聚类（圈）——GO|KEGG——GO|KEGG富集分析“，右侧分子列表粘贴刚才的18个核心基因，富集分析条目可选择GO+KEGG、全部GO条目或KEGG等类型，提交分析，保存结果，下载结果三线表，即得到发表级分析结果

3.9 Fig.8 LUAD中RAB11FIP1表达与免疫浸润水平的关系

图8 A为TIMER数据库（https://cibersortx.stanford.edu/）中RAB11FIP1拷贝数变异与免疫细胞浸润的相关性分析箱式图与散点图组合

1）进入TIMER数据库，上方的功能模块中选择“SCNA“，肿瘤类型处选择“LUAD”，目标基因为”RAB11FIP1”，免疫浸润细胞与原文一致，即默认的6种细胞类型与顺序，提交分析，下载分析结果图片即可

2）图8 B为RAB11FIP1高、低表达两组种28种免疫细胞浸润箱式图，进入仙桃学术“交互网络（联）——免疫浸润——[云]分组比较图”，选择LUAD数据集，右侧“分子“输入RAB11FIP1，”算法参数“中”细胞“仙桃学术提供了aDC、B cells、CD8 T cells、Cytotoxic cells、DC、Eosinophils、iDC、Macrophages、Mast cells、Neutrophils、NK CD56bright cells、NK CD56dim cells、NK cells、pDC、T cells、 T helper cells、Tcm、Tem、TFH、Tgd、Th1 cells、Th17 cells、 Th2 cells与Treg等20余种免疫细胞类型，”箱/柱“中可对图片配色方案等进行个性化调整，设置坐标轴文本旋转30°，提交分析，得到原文Figure 8B同款图片

3.10 Table3TIMER数据库分析RAB11FIP1基因与免疫细胞标志基因相关性

表3为TIMER数据库分析RAB11FIP1基因与免疫细胞marker gene的相关性分析结果表格

进入TIMER数据库，上方的功能模块中选择“Correlation“，肿瘤类型选择”LUAD“，x轴基因为RAB11FIP1，y轴基因分别为各类免疫细胞的marker gene，根据”tumor purity“进行校正，提交分析，得到分析结果图，将图中的参数结果整理为word三线表即可

3.11 Table4GEPIA数据库中RAB11FIP1和TIICs标记基因的相关性分析

表4为GEPIA数据库分析RAB11FIP1基因与TIICs （tumor-infiltrating immune cells，肿瘤浸润免疫细胞)marker gene的相关性分析结果表格

进入GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/），选择“Single Gene Analysis”，输入目标基因“RAB11FIP1”，开始分析。上方的功能模块中选择“Correlation”分析，x轴基因，即 ”Gene A” 选择 ”RAB11FIP1“，y轴基因，即 ”Gene B“ 为TIICs的marker gene，“TCGA Tumor”选择“LUAD“，提交分析，得到相关性分析的pvalue与相关系数R，整理为word三线表即可

现在文章中所有的图表都复现完毕啦~ 最后依然是我们的保留节目——全文总结

4.文章思路总结

挑

RAB11FIP1在肺腺癌中的表达水平（Figure1）

RAB11FIP1在肺腺癌不同亚组中转录水平（Figure2）

LUAD中基因差异表达与RAB11FIP1的相关性（Figure5）

圈

GO条目与KEGG通路GSEA富集分析（Figure5）

GSEA分析LUAD中RAB11FIP1共表达基因的GO注释和KEGG通路（Figure6）

联

PPI网络的Top2 核心模块（Figure7）

LUAD中RAB11FIP1表达与免疫浸润水平的关系（Figure8）

TIMER数据库分析RAB11FIP1基因与免疫细胞标志基因相关性（Table3）

GEPIA数据库中RAB11FIP1和TIICs标记基因的相关性分析（Table4）

靠

Logistic回归分析RAB11FIP1表达水平与临床病理参数关联（Table1）

RAB11FIP1表达水平与LUAD预后关联（Figure3）

LUAD患者临床病理参数单、多因素Cox分析表格（Table2）

5.全文总结

本文以RAB11FIP1基因为主变量，以纯生信分析的手段分析了肺腺癌中RAB11FIP1的异常低表达与肿瘤的预后、生存等临床关联。主变量为其他肿瘤中首次报道，但尚未有肺腺癌中的研究，属于变量移植类研究

本篇文章生信分析内容可由7个在线数据库全部复现完成，复现难度偏低，零成本低耗时发到接近5分的3区文章，不比在实验室摸爬滚打，和各种有毒有害试剂打交道、甚至还有危险操作可能的基础文章香太多

原文“挑圈联靠”四字箴言面面俱到，由TIMER数据库分析了主变量拷贝数变异与免疫细胞浸润的关系，此处还可扩展延申，如分析LUAD中RAB11FIP1表达显著降低与基因突变、抑癌相关生物学效应的异常改变，以及主变量RAB11FIP1是否具有临床诊断、预后相关预测价值。还可增加外部数据集，如GEO数据库中肺腺癌数据集补充验证；文章若有继续深入研究打算，可再挖掘RAB11FIP1异常低表达的下游生物学效应及其作用靶点，以及异常表达的上游机制；若有较好结果，还可在通过伦理审批后收集临床相关标本进行检测，增加实际应用转化价值。

欢迎大家关注解螺旋生信频道-挑圈联靠公号~

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